一种针对脂多糖转运蛋白的新型抗生素类

　　使用肉汤微稀释法以及与CLSI指南M07和M100一致（参考文献37,38）进行MIC测定。通过在CAMHB中稀释0.5 McFarland悬浮液或专门针对A. baylyi分离株的溶菌性肉汤（LB）来制备细菌接种物。然后，用适当的细菌细胞接种了96孔微滴定板，其中包含MCPS或护理标准抗生素的串行两倍稀释溶液，以每毫升约5×105 cfu的最终接种物和所需的抗菌剂测试浓度的最终接种物。在视觉检查或在A. aylylyi ATCC A. 33305和相应的构造突变体的情况下，将测试板孵育20至24小时（对于所有的杆菌分离株）或16至18 h（对于非杆菌分离株）或在600 nm（OD600）的光密度之前（OD600）和读取光密度。所有测试过的抗生素的MIC值均被读为最低的化合物浓度，肉眼抑制细菌的生长，或者OD600停止降低。当使用标准CAMHB非供应培养基测试MCP化合物时，观察到尾随现象的一部分分离株，这些分离物使MIC端点读数模棱两可。因此，对于在非补充培养基中测试的MCP，与生长控制相比，最低浓度至少显示出生长降低（MIC 80％），此外还记录了MIC除了读取为完全的生长抑制作用（MIC 100％）外。或者，在补充20-50％人血清的CAMHB中进行了MIC测试，这种疾病可以缓解尾随，并且仅在100％生长抑制的终点读取。 　　如先前所述的26 baumannii进行了样品制备和分析，生成和分析的数据集由三个独立实验n = 3组成，是该协议的唯一修改。 　　在连续稀释液（1％DMSO中为3.125–100μm）中制备化合物，并与阳性（星形孢菌素）和阴性（无化合物）一起转移至384孔板。In total, 25 μl of HEK293 cells (ATCC; verified by short tandem repeat PCR and mycoplasma negative) (50,000 cells per ml) were added in either low-serum-containing (0.5% fetal bovine serum (FBS)) or high-serum-containing (12.5% FBS, 1% BSA) medium (Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM), glucose,- 谷氨酰胺）。将板在37°C下孵育24小时，并将CelltiterGlo的混合物和DMEM的混合物添加到板中。在室温下孵育后，使用BioTek读取器读取发光信号，并从数据中得出计算出的IC50。 　　在Eurofins Cerep SA上使用先前描述的50个非目标的定制面板在Eurofins Cerep SA上进行了脱离目标筛查，并在具有10μM测试化合物的情况下以单点测量为单点测量，并报告为辐射信号或控制酶活性的抑制百分比。 　　全血是从Wistar大鼠获得的，并在1.2 mL肝素管中收集以制备肝素血浆。然后将管子在室温下5200克离心5分钟，以分离血浆上清液。测试化合物作为粉末接收，并在0.9％氯化钠溶液中以各种浓度溶解，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）对pH进行调节。该测定是在384孔板中进行的。将大鼠血浆（10 µL）添加到10 µL各种化合物溶液中。在血浆中添加了总共10 µL的媒介物（0.9％氯化钠溶液，PBS）作为阴性对照。在362 nm处测量吸收。原始数据作为吸光度数据获得。计算了样品的吸光度与车辆的平均吸光度之间的差异。最小效应浓度定义为最低浓度，可吸光度差为OD362≥0.05。 　　为了进行体外血液解析测试，罗氏医疗服务通过匿名献血计划提供了血液，该研究计划获得了伦理委员会西北瑞士和瑞士中部（EKNZ）的批准，并得到知情同意。血液是通过静脉穿刺中的乙二胺乙酸乙酸（EDTA）和锂肝素涂层的试管收集的。通过离心（2,500G； 10分钟；在室温下）从抗凝血液中制备血浆，并测量血细胞比容以确保其在正常参考值之内。将盐水中化合物的每种配方以8 mg ml -1的浓度加入含有0.5 ml的超甲基甲基血液的测试管中，以获得最终测定量为1 ml，浓度为4 mg ml -1或更低（在进一步稀释后）。在37°C下在水浴中孵育10分钟后，将管子离心（10分钟，室温下的1,811克），然后将100μl上清液转移到含有5 ml Drabkins溶液（Randox Laboratories）和1 ML磷酸盐的测试管中。根据randox测试量指示，在540 nm的光度法上测定血红蛋白。结果表示为从0％，50％和100％血液样本的内标曲线外推出的溶血百分比。 　　对于血浆沉淀测定，将化合物的测试项目配方如下（0.9％氯化钠溶液）稀释：未稀释，1：2，1：2，1：4，1：8和1：16。然后将这些系列稀释液添加到包含0.5 mL血浆的测试管中，最终测定量为1 ml，最终浓度为4 mg ml -1分析量或更少。在样品离心（1,811g; 10分钟；在室温下）后，通过对所得的颗粒进行评分（得分：0，无; 1，轻度; 2，中度; 3，标记）来视觉确定血浆沉淀。 　　根据CLSI标准程序M26-A40进行了时间 - 杀伤研究。扎苏拉巴蛋白的浓度范围从上方和以下进行，在MIC（128稀释至128至0.25×MIC）范围内进行测试，并且对照化合物colistin在4×MIC下使用。将来自琼脂板的鲍曼尼菌菌落接种到补充20％人血清的CAMHB中，并在摇动的环境空气中在35±2°C的35±2°C下孵育过夜。隔夜培养被稀释1：10,000，并进一步孵育2小时。总共将5 mL的细菌对数悬浮液转移到六孔板中。总共添加了50μl的100抗抗生素串行双重稀释溶液，该溶液是根据MIC测试范围的已建立的多个稀释溶液添加的。将六孔板在摇动（100 rpm）的环境空气中孵育24 h，在选定的时间点（0、2、2、4、8、12、16、20和24 h）处取出150μL，稀释，稀释，铺在Mueller – Hinton-Hinton琼脂板上的过夜，以供Cfu ucunections CFU。GraphPad Prism V.8用于数据的图形表示。 　　对于单步自发性突变研究，针对每个菌株测试了与琼脂MIC倍数（2×，4×，4×，8×和16×MIC）相对应的四个浓度的Zosurabalpin。在20倍的最终浓度下将熔融的Mueller – hinton琼脂（19mL）补充了20％的人血清，并立即倒入培养皿（直径100毫米）中，并轻轻混合。然后，将来自琼脂板的2-3个菌落接种到CAMHB中，并在摇动下孵育过夜（150 rpm）。总共100μl细菌悬浮液（约108 cfu的接种物）被扩散到含有佐罗巴蛋白的琼脂板上，而没有抗生素的生长控制板。将琼脂板在35±2°C下进行有氧孵育。24小时后，计算在板上生长的菌落，并确定自发突变频率，因为在化合物上对接种物尺寸的菌落数量计数。每个条件最多有8个菌落，包括不同的形态类型，测试了MIC测定和全基因组测序。 　　使用Magna Pure病原体通用方案200（Magnapure 96系统，Roche）提取基因组DNA，并用作文库制备的输入。对于短阅读的测序，使用Illumina Nextera XT库制备套件（Illumina）制备库。在DDL Diagnostik实验室使用配对的150 bp循环协议，将库在Illumina NextSeq系统上进行了多路复用，聚类和测序。除去包含适配器和/或噬菌体PHIX对照序列的读取，并使用三动（V.0.36）41进行修剪。对父母菌株的修剪读数用于通过使用黑桃（v.3.12）42进行从头组装（v.3.12）42激活（ - 贴合参数）并使用Prokka（V.1.14.0）43使用NCBI A. Baumannii Asmannii sasgbly（Asm975975975968v1;参考。通过映射从衍生菌落绘制衍生菌落读取到相应父母的基因组草案，使用基因组短读核苷酸比对程序（GSNAP V2016-08-24）44使用默认参数，从而进行了衍生物突变体中的单核苷酸多态性检测。使用Samtools45，Awk脚本和Picard Tools（Broad Institute）删除了重复的读数。使用freebayes（v.1.1.0）进行变体调用，然后使用BCFTools47进行过滤，以删除相应的父菌株中存在的变体，并需要读取深度> 5和变体频率> 0.8。 　　对于基因组DNA的长阅读测序，使用无扩增的SQK-LSK109库制备方案（Oxford Nanobore Technologies（ONT））制备了库。使用EXP-NBD104或EXP-NBD196协议（ONT）将库多路复用，并使用R9.4.1的流动单元格在72 h内在ONT网格序列上进行测序。原始测序数据在测序期间使用Guppy（v.3.2.8或V.3.2.10）和高纯度基础基本调用模型（DNA_R9.4.1_450BPS_HAC.CFG; ONT）进行了基础测序数据。首先，由CANU（v.2.0）48从RAW ONT读取中生成混合组件，然后将ONT读取为MiniMAP2（v.2.17-R941）49。对齐方式首先用RACON（v.1.4.16）50，然后使用Pilon（V.1.23）51的修剪，未塑造的Illumina Reads读取10轮抛光，然后用ANT读取10轮。如上所述，使用Prokka（V.1.14.5）43进行了抛光杂种组件的蛋白质和基因注释。与使用滑动窗口方法相比，与母体菌株相比，混合组件用于鉴定衍生突变体中的大插入。使用ISFinder（2020年11月10日的数据库）进行注释插入元素52。 　　使用定制的连续培养装置Morbidostat的实验进化方法基于先前引入的原理53。在大肠杆菌中的三氯生和三种革兰氏阴性物种中的三氯糖剂研究中，建立了并验证了虫比托塔特的实施以及整个实验和计算工作流程，包括baumannii Atcc A. atcc 17978（参考文献28）。简而言之，基于畸形的工作流程包括：（1）在6个平行的反应堆中具有常规计算机控制的培养基中的6个平行反应堆中的鲍曼尼氏抗体生长，导致药物浓度逐渐升高；（2）从细菌种群样本中作为时间序列进行的总基因组DNA的测序（约700–1,000×基因组覆盖率）；（3）鉴定和定量序列变体（突变，小插入 - 缺失突变，插入序列插入，基因组重排），以推断进化动力学和抗性机制；（4）通过对选定克隆的测序和MIC测定确认主要突变变体的影响。A. baumannii菌株ATCC17978和ATCC19606来自ATCC，两个临床分离株ROB08705和ROB08706来自Roche Collection。起动文化和增长媒体如下。在CAMHB（Teknova）在37°C的CAMHB（Teknova）中，将甘油量的等分试样生长到约0.3的OD600，每种培养物用2 ml的Morbidostat反应器接种了Morbidostat反应堆，具有不同的培养基的20 mL，具有或具有20％HumanDrich HumanDrich HumanDrich（Sigma-Aldrich，H45522，H45522）。药物给药如下。DMSO中的Zosurabalpin化合物的10 mM储备溶液用于制备含药物的培养基，然后通过MHB培养基在微滴定板中的2％DMS​​O中的连续稀释液制备MIC测量。实验进化在Morbidostat中运行包括两个阶段，从药物培养基中的2μMZosurabalpin开始，直到达到中间电阻高原（通常在48小时内） 随后在20μm（在接下来的24-36小时内）的扎苏拉巴泊蛋白增加了十倍。通常每天采集样品（10 mL）的细菌群体，并用于（1）分离总基因组DNA进行测序，（2）准备甘油量以进行进一步的克隆分析。 　　使用高覆盖的Illumina测序（见下文），基于组装和基于RAST的注释，如ATCC17978菌株28所述，分析了每个菌株的所有六个起动培养物（A1-A6）。获得的基因组组件（在补充信息基因组组装文件中提供），包括已识别的已有序列变体，用作识别和分析进化样品中序列变体的框架。 　　DNA was extracted using the GenElute Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich), analysed by Qbit and used for library preparation using one of the two protocols (kits): (1) the NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit for Illumina (New England BioLabs) using TruSeq DNA UD Indexes 20022370 (IDT) without PCR amplification;或（2）带有适配器（Seqwell）的Plexwell PW384套件。使用定量PCR和质量控制分析（2100生物分析仪）进行定量后，通过Novogene（2×150配对末端）对库进行测序，平均人群的基因组覆盖率为500-1,000×基因组覆盖率，而隔离克隆的人群为100-200×。为了验证是插入的，通过纳米孔（牛津纳米孔技术）使用纳米孔快速条形码盒SQK-RBK004（牛津纳米技术），还通过纳米孔（带有FLO-MIN106流动池的牛仔群）测序对某些克隆进行了分析。 　　如先前所述进行了初始变体调用的计算管道，可在线下载（https://docs.conda.io/projects/conda/en/latest/latest/index.html）。（1）最大相对丰度（Amax，％）对潜在相关的不存在和非同义突变变体进行排名。至少一个事件与Amax≥10％不同的事件与Amax≥2％的事件有关的所有基因均通过（2）每个基因突变事件的独立发生（n）的数量（n≥2）选择进一步排名。 　　自制的TRIS-HCL 4–20％聚丙烯酰胺梯度凝胶或4–20％迷你蛋白酶TGX预制蛋白凝胶（Bio-RAD）用于Tris-Gycine跑步缓冲液。2×SDS样品加载缓冲液是指含有125 mM Tris（pH 6.8），4％（w/v）SD的混合物，30％（v/v）甘油，0.005％Bromophenol Blue和5％（V/V）（V/V）β-甲醇。在200 V时运行SDS -PAGE凝胶45至60分钟。通过SDS -PAGE分析了纯化的蛋白络合物，然后用Coomassie Blue（Alfa Aesar）染色，并使用Azure Biosystems C400成像剂的凝胶特征进行成像。对于蛋白质印迹，将蛋白质转移到免疫印迹PVDF膜（Bio-Rad）上。然后使用无菌过滤的酪蛋白阻止缓冲液（Sigma-Aldrich）封闭膜，然后与适当的抗体孵育。针对LPS核（Hycult Biotechnology），绵羊抗小鼠辣根过氧化物酶（HRP）偶联物二抗（GE Amersham）和小鼠抗HIS抗HIS TAG HRP HRP CONJUGATE抗体（BioLegend）的小鼠单克隆抗血清用于Immunoblots。使用ECL Prime Western印迹检测试剂（GE Amersham）和Azure C400成像系统可视化频段。补充图1中提供了无工艺的免疫印迹。 　　A. Baylyi ADP1（ATCC 33305）基因组DNA的PCR扩增了编码LPTB，LPTC和LPTFG的基因。Gibson Assembly（New England Biolabs）将LPTB和LPTFG PCR产品插入PCDFDUET中，以生成类似于其他LPTB2FG同源物的质粒55。将LPTC PCR产品插入带有C末端凝血酶裂解位点和HIS7标签的PET22/42中。寡核苷酸引物购自Eton Biosciences或Genewiz。本研究中使用的质粒和菌株在提供的质粒序列的补充表8和9中报道。 　　根据先前报道的程序56,57进行了培养，基因操纵和MIC测量。Point mutants were constructed in a two-step procedure as described previously58 with the introduction and excision of the integration cassette at codon 66 of pepA, wherein the excising fragment of otherwise wild-type chromosomal DNA sequence from codon 406 of pepA to codon 193 of lptG bore the desired mutation, and the resulting clones were screened by amplicon sequencing from codon 81 of holC to codonGPMI的501。在Amplicon确认后，对每个构建突变体的三个经过验证的分离株进行了对具有已知作用机制的一组抗生素的敏感性，作为确保在所有情况下确认表型的进一步验证步骤，以确保在所有情况下确认，并以后在此处报告了验证的重复项之一。 　　如前所述，LPTB2FGC复合物被纯化，并对LPTB2FG进行了轻微的修饰59。将含有PCDFDUET-LPTB-LPTFG和PET22/42-LPTC-凝血酶-His7的大肠杆菌C43（λDE3）的隔夜培养物稀释到含有50 mg L-1尺寸霉素和50 mg L-1 Carbenicillin的LB中。细胞在37°C下生长至0.8左右的OD600。然后，添加200μM异丙基β-1-甲状腺乳糖苷糖苷（IPTG），加入0.2％的葡萄糖，并使细胞再生长2-3小时。通过离心（4,200G，20分钟，4°C）收集细胞。使用液氮闪烁细胞颗粒，并存储在-80°C下。除非另有说明，否则在4°C下进行所有后续步骤。 　　Thawed cell pellets were resuspended in lysis buffer (50 mM Tris (pH 7.4), 300 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 100 μg ml−1 lysozyme, 50 μg ml−1 DNase I, 1 cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablet per 40 ml) homogenized, and subjected to passage using an乳液-C3高压细胞破坏者三次。将细胞裂解物离心（10,000g，10分钟），然后将上清液进一步离心（100,000g，1 h）。将所得的沉淀重悬于溶解缓冲液中（20毫米Tris（pH 7.4），300 mM NaCl，15％甘油，5 mM MGCL2，1％（w/v）DDM（Anatrace Maumee），100μmpmsf，2 mm pmsf，2 mm atp）和4°C摇摆。将混合物离心（100,000g，30分钟），将上清液用咪唑[终浓度均匀15毫米，然后用Ni-NTA Superflow树脂（QIAGEN）摇动1小时。然后将树脂用2×10柱体积亲和力缓冲液洗涤（300 mM NaCl，20 mm Tris（pH 7.4），10％甘油，0.015％（w/v）DDM），其中含有20 mm咪唑，随后是含有2×15柱量的亲和力料，含有35 mm immmmmmm。Protein was eluted with 2 × 2 column volumes affinity buffer containing 200 mM imidazole, concentrated using a 100 kDa molecular mass cut-off Amicon Ultra centrifugal filter (Millipore) and purified by size-exclusion chromatography on a Superdex 200 increase column in SEC buffer (300 mM NaCl, 20 mM Tris (pH 7.4), 5% glycerol, 0.05% DDM,0.5 mM Tris（羟丙基）磷酸）。将尺寸排斥色谱后收集的分数与限制级凝血酶（Sigma-Aldrich）孵育过夜，以裂解其标签。用8 mM咪唑加标溶液，并通过通过Ni-NTA树脂和苯甲酰胺Sepharose去除未切换的蛋白质。合并馏分，并使用100 kDa分子质量截止氨基分析滤波器浓缩至7-8 mg ml-1。然后在脂质体中制备蛋白质，如下所述。 　　如先前所述59，纯化了LPTAI36PBPA。In brief, E. coli BL21 (λDE3) cells containing pSup-BpaRS-6TRN and pET22b-LptA(I36Am) were grown to an OD600 of around 0.6 at 37 °C in LB medium containing 50 μg ml−1 carbenicillin, 30 μg ml−1 chloramphenicol and 0.8 mM ultraviolet-irradiation-cross-linkable amino酸P​​-苯甲酰苯丙氨酸（PBPA）（BACHEM）。然后用50μM异丙基IPTG诱导细胞；允许生长2小时；集;重悬于含有50 mM Tris-HCl（pH 7.4），250毫米蔗糖和3毫米EDTA的混合物中；在冰上孵育30分钟；和颗粒（6,000克，10分钟）。将上清液补充了1 mM PMSF和10 mM咪唑并颗粒（100,000克，30分钟）。将上清液与Ni-NTA树脂一起孵育，然后将其洗涤两次（20柱体积为20 mm Tris-HCl（pH 8.0），150 mM NaCl，10％（V/V）甘油和20 mM咪唑）。将LPTA洗脱了两次（2.5列的洗涤缓冲液，补充了额外的180 mM咪唑），使用10 kDa切断的氨基氨基离心浓缩剂（Millipore）浓缩，闪光液体，并在-80°C下储存，直到使用。 　　如先前所述，制备了蛋白脂质体59。简短地将水性大肠杆菌极性脂质提取物（Avanti极性脂质）（30 mg ML-1）和来自大肠杆菌EH100的水溶液（RA突变体； Sigma-Aldrich）（2 mg ML-1）简短地超声处理均质化。制备了20 mM Tris-HCl（pH 8.0），150 mM NaCl，7.5 mg ML-1大肠杆菌极性脂质，0.5 mg ML-1 LPS和0.25％DDM的混合物，并在冰上保持10分钟。将纯化的LPTB2FGC添加到0.86μm的最终浓度中，并将混合物放在冰上持续20分钟。将混合物用冷20毫米Tris-HCl（pH 8.0）和150毫米NaCl稀释100倍，并在冰上保持20分钟。将蛋白脂质体固定（300,000g，2 H，4°C），重悬于20 mM Tris-HCl（pH 8.0）和150 mM NaCl中，稀释100倍和离心（300,000G，2 H，4°C）。将沉淀重悬于20 mM Tris-HCl（pH 8.0），150 mM NaCl和10％甘油（每100μl原始倾向溶液250μl）的混合物中，通过超声处理，闪光液和储存在-80°C直至使用。 　　如先前所述55，测量了从蛋白质脂质体到LPTA的LPS释放水平。测定在含有50 mM Tris-HCl（pH 8.0），500 mM NaCl，10％甘油和2 µM LPTAI36PBPA的溶液中使用60％的蛋白质体（按体积）。在适用的情况下，将反应混合物与药物在室温下孵育10分钟。然后通过添加ATP和MGCL2（分别为5 mm和2 mM）启动反应，并在30°C下进行。从反应混合物中除去等分试样（25 µL），并使用B-100AP灯（Thermo Fisher Scientific）在冰上用紫外光（365 nm）辐射10分钟。紫外线照射后，加入25 µL 2×SDS-PAGE样品加载缓冲液，将样品煮沸10分钟，并使用Tris-HCl 4–20％聚丙烯酰胺梯度凝胶分离蛋白质，该蛋白质具有Tris-Glycine运行缓冲液。如上所述进行了免疫印迹。 　　小鼠药代动力学研究和大鼠安全研究是在罗氏进行的，所有程序均按照各自的瑞士法规进行，并得到了庞大的动物研究伦理委员会的批准，并在由实验动物护理国际（AAAALAC）评估和认证协会认证的设施中进行了认可的设施（AAAALAC）（AAAALAC）（AAAALAC）（AAAALAC）（AAAALAC）（动物研究许可证，2395）。评估化合物疗效的药效学研究是在EVOTEC公司Autuit Verona进行的，并受到欧洲指令2010/63/UE管理动物福利和保护的约束，这是由意大利立法法令否所承认的。26/2014和公司对实验动物的护理和使用政策。所有动物研究均由动物福利机构修订，并经意大利卫生部（51/2014-PR）批准，并在经过评估和认证实验室动物护理国际（AAAALAC）（AAALAC）（认可的单位，001090）认可的设施中进行。CD-1小鼠到达时为6周​​（最低适应5天）。Wistar Han Igs Crl：Wi（Han）大鼠在服用时大8周。到达时将小鼠随机分配给治疗组。根据体重将大鼠随机分配到组/笼子。 　　用化合物制剂（0.5 mg ml -1在0.9％氯化钠溶液中）给予三只雄性CD1小鼠，作为每公斤1 mg的静脉注射剂量。给药后，以0.08、0.25、0.5、1.5、1、2、4、7和24小时采样血液，并在室温下在5,200g的5,200克离心5分钟，以分离血浆上清液。使用液相色谱 - 质谱法分析血浆中化合物的浓度，其校准范围为5-10,000 ng ml -1。药代动力学参数来自单个浓度数据，并通过非室内分析估算。 　　每组四只雄性Wistar大鼠施用0（媒介物对照），每天0.6或6.0 mg的RO7075573或Zosurabalpin作为缓慢的静脉输注五天（0、0.12或1.2 mg Ml -1在0.9％的氯化钠溶液中）。对耐受性的评估是基于死亡率，内部观察，体重，食物消耗和临床病理学的评估。此外，在第6天的未定计划或计划的安乐死进行了严重的病理学和组织病理学。 　　通过腹膜内接种测试的宝曼氏菌分离株的细菌悬浮液在CD-1免疫能力的雄性小鼠中诱导败血病，在确定的中位数中位数高于致死剂量上方约1-2 log [CFU]的挑战下（每只小鼠105至107 CFU）。RO7075573的剂量（范围从0.01 mg每公斤到每公斤1毫克）或Zosurabalpin（范围从0.3至每公斤0.3至30 mg），对照标准的护理抗生素（单剂量的Meropenem在单剂量上测试）和载体（无菌盐溶液）和载体（无菌盐溶液）的均采用了次要的1和5小时。在6-7天内遵循小鼠的生存。GraphPad Prism 8用于图形显示数据。如上所述，使用对父母分离物确定的细菌挑战进行了在抗性研究中获得的突变衍生物分离株的败血病研究。扎苏拉巴蛋白以每公斤30毫克的剂量皮下施用。 　　在雄性CD-1小鼠中诱导中性粒细胞减少，通过在使用MCPS（RO7075573或ZAB）或Care抗生素（Colistin，Meropenem或Tigecycline）治疗之前，通过在第-4天进行两次连续的腹膜注射和环磷酰胺一水合物（CPM）的第-1天和第-1天。肌肉内接种细菌悬浮液的每只大腿约106 CFU用于诱导感染。感染后2小时开始治疗。RO7075573的总剂量每4小时每公斤1.8至180毫克每公斤1.8至180毫克。扎苏拉巴平的总剂量，每6小时每公斤6至360毫克每公斤每公斤6 h。治疗24小时后确定大腿细菌负担。在肺炎模型中，使用每肺CFU大约107 CFU的气管内接种来诱导感染。感染后2小时开始治疗。扎苏拉巴平的总剂量，每6小时每公斤6至360毫克每公斤每公斤6 h。24小时治疗后确定肺细菌负担。在两种感染模型中，都以单剂量测试了护理标准抗生素。GraphPad Prism 8用于图形显示和分析数据。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。