产生骨骼的母性脑激素

　　根据加利福尼亚大学，旧金山大学（UCSF）机构动物护理委员会（IACUC）或加利福尼亚大学戴维斯分校（UCD）动物Ethics委员会，美国国立卫生研究院的实验室动物护理指南指南及其国际疼痛研究的建议。这项研究中使用的动物范围为1至70周龄，包括雄性和雌性小鼠。 　　ESR1FL/FL等位基因（官方等位基因：ESR1TM1SAKH）在129p2背景上的起源，并用于生成ESR1NKX2.1-CRE小鼠，并已在CD-1; 129p2混合背景上进行了描述。补充表1列出了用于基因分型的底漆序列。通过跨越携带CAG-Luc-GFP等位基因的CAG-Luc-GFP（官方等位基因：L2G85CHCO/J）的雄性小鼠，产生ESR1NKX2.1-CR-CAG-CAG-LUC-GFP小鼠，从ESR1FL/fl; nkx2.1-cre; luc-GFP菌落维持在混合FVB/N，CD-1、129P2和C57BL/6遗传背景上。通过将纯合ESR1FL/FL雌性交叉至prodynorphin-cre（B6; 129S; 129S-PDYNTM1.1（CRE）MJKR/LOWLJ），从Jackson Laboratoratory购买的MJKR/LOWLJ来产生ESR1-ProdyNorphin-Cre小鼠。将小鼠维持在12小时的光线周期中，并随意使用标准育种饮食（Picolab 5058; Labdiet，4 kcal％脂肪，0.8％Ca2+）和无菌水，并在受控和受监测的房间内容纳温度和湿度。通过NIA NIA NIA资助的项目获得了18个月大的和24个月大的C57BL/6雌性和雄性小鼠。为了创建OVX女性队列，在4个月大时进行了卵巢切除术，然后进行4周的手术恢复。所有动物程序均根据Ingraham和Ambrosi Laboratories的机构动物护理委员会的记录协议，根据UCSF和UCD机构指南进行。 　　抛物线手术遵循先前描述的程序51。简而言之，6周龄的ESR1FL/FL和ESR1NKX2.1-CRE女性通过皮肤在左右两侧进行了镜像切口，并通过腹壁进行切口。将相邻抛物线的腹膜开口一起缝合在一起。此外，将每个对抛物线的肘部和膝关节缝合在一起。然后将每只老鼠的皮肤切口钉。每只小鼠在手术恢复过程中皮下注射en lo霉素（Baytril，Bayrer）抗生素和丁丙诺啡（Butler Schein），并监测。为了监控对的健康，每周监控它们的体重和修饰行为。通过从未注入的抛物线的下颌下向200 µl的0.5％Evans蓝色注入200 µl的0.5％Evans蓝色后，通过在2小时收集的血液中存在Evans Blue Dye来检查配对。 　　使用Scanco Viva CT40高速µCT临床前扫描仪进行体内µCT以确定小梁骨量的变化。在扫描之前，将小鼠麻醉并放在3D打印的鼻锥中以容纳手术配对的小鼠。在基线（0）手术后2周，对Parabiont组中每只小鼠的远端股骨（与切口侧相对），然后在基线成像后3、6和17周以保持骨Mass52的时间间隔进行。对旁位的降落伞进行麻醉，并使用对侧股骨远端的2 mM区域（与外科手术配对的一侧相反）用于评估邻接0.4 mm骨区域邻接的0.4 mm区域的焦虑症的侧面板和皮质参数的小梁骨隔室。成像是在Niams Award P30AR075055支持的UCSF骨骼生物学和生物力学核心上进行的。 　　简而言之，从4周大的雌性或雄性ESR1FL/FL小鼠中解剖长骨，在形成水平切口后立即植入皮肤下的骨头，并在肩cap骨的后部小口袋后，在8周大的受体ESR1FL/FL或ESR1FL或ESR1NKX2.1-cre雌性小鼠中。孵育6周后，随后将供体股骨移除并通过离体µCT分析。简而言之，在股骨远端使用Scanco Medical µCT 50样品扫描仪在股骨远端测量体积骨密度和体积，该标本扫描仪校准了校准羟基磷灰石幻影或Bruker Skyscan1276（Bruker Preclinical Imaging）。对于Scanco成像，将样品固定在10％磷酸盐缓冲的福尔马林中，并使用10 mm的素尺寸和X射线管电位为55 kVp和X射线强度为109 µa。扫描的区域包括股骨近端板块的2 mM区域。对于Bruker Skyscan 1276成像，使用2,016×1,344的源电压，85 kV，200 µA的源电流，AI 1 mm的过滤器设置，像素1 mm的过滤器设置为12–20 µm（用于特定实验的样品）。使用CT分析仪和CTVOX软件（BRUKER）分析重建的样品。标准最佳实践用于量化小梁和皮质骨参数52。使用iPhone 13 Pro捕获了植入股骨的图像获取，然后在Photoshop CC中进行了编辑。 　　对于肾脏移植测定，如下所述，从4周大的ESR1FL/FL雌性小鼠分离了主要的OCSSC。将大约20,000个活细胞重悬于2μLMatrigel（Corning，356234）中，并将整个混合物注入8周大的受体小鼠的肾囊中。移植后六周，将动物安乐死，并如下所述处理肾脏移植物。使用相同的设置扫描了带有肾囊移植物和带注射干细胞移植物的肾脏囊移植物和脑组织的肾脏。为了在SSC移植后处理肾脏，解剖肾脏并清洁软组织，固定在4％多聚甲醛（PFA）中，并嵌入OCT中以进行冷冻效果。随后使用标准Movat的Pentachrome染色试剂盒（ABCAM，AB245884）对切片（5 µm）进行染色。使用Luminera Infinity-3拍摄明亮场图像，并使用ImageJ软件进行量化。使用与上述相同的骨移植分析的设置扫描了含有肾胶囊移植物的切除的肾脏。 　　对于脑移植，如下所述，FACS分离ESR1FL/FL-CAG-LUC-GFP OCSSC，并在无菌人造脑脊髓液中保存在冰上（Tocris Bioscience，3525）。细胞分离后大约2小时，通过立体注射（前端（AP）：-1.58; Mential-tailtral（ML）：±0.3; persal- vent – dorsal – veneek trom sklral – deeeks：sklral-neike：-99595-95-95-95-95-95-95-95-95-95-95-95-95-95-95-95-95-95ESR1FL/FL或ESR1NKX2.1-CRE女性。植入后六周，对小鼠进行灌注，并使用标准程序从固定在4％PFA中的大脑中收集的冷冻切除术（20 µM）进行免疫组织化学。GFP染色使用多克隆鸡抗GFP抗体（Novus Biologicals，NB100-1614）1：2,500。使用键B2-x800拍摄图像。使用与上述相同的骨移植测定的相同设置扫描了从雌性小鼠中切除的内侧下丘脑脑组织。 　　流式细胞仪和细胞分选在FACS ARIA II细胞分类器（BD Biosciences）上进行，并使用FlowJo软件进行分析。解剖了人类患者的小鼠长骨头和愈伤组织样品（UC Davis机构审查委员会（IRB）1997852； SCRO-1199）并从周围的软组织中解脱出来，然后随后与先前所述的53,54的机械和酶促步骤解离。为了隔离人类SSC，在UCD医疗中心开放减少骨折内固定过程中，从个体（年龄范围14-72岁）的六个愈伤组织组织样本（14-72岁）被骨折。遵守IRB指南的收集（IRB 1997852-3，基于标本捐赠者的种族，性别或年龄的限制）。根据IRB评估，在这项研究中进行的SSC的隔离不符合人类研究的标准。因此，没有寻求知情同意。仅包括用开放式方法处理的裂缝，并包括裂缝片段的直接重新调整，并在手术期间为研究目的进行了血肿或愈伤组织阻碍的令人满意的移位片段重新调整。如下所述，将切除的组织迅速放在冰上，并在手术后5小时内分离人类SSC。 　　简而言之，将组织置于补充DNase的胶原酶消化缓冲液中，并在恒定搅拌下在37°C下孵育60分钟。胶原酶消化和中和后，通过重复的移液轻轻地进行了未消化的材料。将总解离细胞通过70 µm尼龙网格过滤，并在4°C下在200G上颗粒5分钟。将细胞重悬于 - 氯化铵 - 钾液化缓冲液中，以消除红细胞，并在4°C下在200G下离心5分钟。将沉淀重悬于100 µL染色培养基（2％FBS/PBS）中，并在4°C下用抗体染色至少30分钟（抗体信息可以在补充表2中找到）。由于缺乏碘化丙啶（1：1,000稀释的储备溶液：水中1μgml– 1）信号或DAPI（人类细胞）而被门控。在分析或使用已建立的抗体鸡尾酒组合进行分析之前，进行了补偿，基于对照的门控和FACS隔离。补充表2列出了用于FACS纯化的抗体的完整列表。 　　For mouse SSC lineages, the following antibodies were used: CD90.1 (Thermo Fisher, 47–0900), CD90.2 (Thermo Fisher, 47–0902), CD105 (Thermo Fisher, 13–1051), CD51 (BD Biosciences, 551187), CD200 (Thermo Fisher, MA5-17980), CD45 (BioL​​egend,103110), Ter119 (Thermo Fisher, 15–5921), Tie2 (Thermo Fisher, 14–5987), 6C3 (BioL​​egend, 108312), streptavidin PE-Cy7 (Thermo Fisher, 25–4317), Sca-1 (Thermo Fisher, 56-5981), CD45 (Thermo Fisher, 11–0451), CD31（Thermo Fisher，12-0311），CD140A（Thermo Fisher，17-1401）和CD24（Thermo Fisher，47-0242）。 　　For human SSC isolation, the following antibodies were used: CD45 (BioL​​egend, 304029), CD235a (BioL​​egend, 306612), CD31 (Thermo Fisher Scientific, 13-0319), CD202b (TIE-2) (BioL​​egend, 334204), streptavidin APC-AlexaFlour750 (Thermo Fisher,SA1027），CD146（Biolegend，342010），PDPN（Thermo Fisher Scientific，17-9381），CD164（Biolegend，324808）和CD73（Biolegend，3444016）。 　　在这项研究中，仅使用新鲜排序的原代小鼠或人类OCSSC。通过FACS分离细胞后，如上所述培养原代细胞。将小鼠细胞与10％FBS和1％青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher，15140-122）中的最小必需培养基α（MEMα）培养，并在37°C的孵化器中与5％CO2保持。在MEMα（Fisher Scientific，12561-056）中培养人类细胞，该细胞具有10％人血小板衍生的裂解物（干细胞技术，06960）和1％青霉素 - 链霉素溶液（Thermo Fisher Scientific，15140-122）。为了诱导成骨分化，补充了诱导成骨的因子，100 nm地塞米松，0.2 mM-抗甲酸2-磷酸盐和10mMβ-甘油磷酸盐14天。 　　For testing of candidate factors (mCCN3 (Novus Biologicals, NBP2-35100), hCCN3 (Novus Biologicals, NBP2-35084), mFST (Novus Biologicals, NBP2762685U), hFST (Stem Cell Technologies, 50-197-6487), BAM-22P (Sigma, SCP0057), met-ENK（Sigma，M6638）和HGRP（Raybiotech，230-00695-10）），将浓度添加到定义的培养基中，并用新鲜的培养基更改。然后将细胞用福尔马林固定，并用蒸馏水中的2％艾他林红色S（Roth）染色。用PBS洗涤两次井，并用蒸馏水洗涤一次。油红O染色是通过在室温下用4％PFA固定4％PFA的细胞使用油红O工作溶液从异丙醇中的0.5％储备溶液制备的，并以3：2的比例用蒸馏水稀释。在室温下过滤工作溶液并将其应用于固定细胞至少1小时。在评估之前，用自来水洗涤细胞四次。CFU-F测定法是通过将定义的所需细胞群体数量定义的细胞数量分为含有膨胀培养基的单独培养皿进行的。媒介每周更改两次。在培养第10天，固定细胞并用晶体紫（Sigma）染色。 　　对于体外破骨细胞生成测定，如前所述55，从3个月大的C57BL/6雄性小鼠中分离出骨髓巨噬细胞。对于破骨细胞的产生，用30 ng ML – 1 M-CSF和10 ng ML – 1 RANKL（R＆D Systems）进行了有或没有重组MCCN3（0.25 m和2.5 m和2.5 m）（R＆D Systems，1976-NV-050）的10 ng ML – 1 RANKL（R＆D Systems）4天，每天进行中等交换。在第4天，用4％PFA固定细胞，并根据制造商的方案（Sigma-Aldrich）进行陷阱染色。计数每个孔有两个或多个核的陷阱阳性细胞。每个治疗组从四只小鼠那里获得骨髓巨噬细胞。 　　HFD购自研究饮食（D12492，60 kcal％脂肪，0.78％Ca2+）。从10周龄开始，将ESR1FL/FL和ESR1NKX2.1-CRE小鼠维持在HFD上17周。葡萄糖耐受性测试是在6小时后用葡萄糖施用（i.p.，1.0 g kg – kg – 1 OF体重）进行的。对于葡萄糖耐量测试，对小鼠进行了6小时的禁食（大约ZT2开始），并注入葡萄糖（i.p.，1 g kg – 1）。葡萄糖注射后的15、30、45、90和120分钟，在基线时在基线时收集尾血样品。使用手持葡萄糖（Roche，Accu-Check Compact）定量血糖水平。对于非固定甘油三酸酯的测量，从27周龄的ESR1FL/FL和ESR1NKX2.1-CRE小鼠收集全血中，将其放入EDTA处理的管（Microvette CB 300 K2E）中，并直接放置在冰上。为了分离血浆，在4°C下以2,000克的旋转为2,000克，并收集上清液。然后根据制造商的协议，使用市售试剂盒（Cayman Chemicals，10010303）测量非燃烧的等离子体甘油三酸酯水平。分析之前，将所有血浆样品存储在-80°C下。通过双能量X射线（Dexa，Ge Lunar Piximus）获得确定瘦和脂肪质量的体内组成。LCD购自Teklad（TD.95027，14.7 kcal％脂肪，0.01％Ca2+）。为了进行哺乳研究，分娩后将ESR1FL/FL女性的子集​​从标准饲养员Chow中切换为12天，然后在收集长骨骼之前使用上述参数用于Bruker Skyscan 1276 Imaging。 　　使用Scanco Medical µCT 50标本扫描仪在右股骨下测量了喂养SD和HFD的小鼠的体积骨密度和BV，该骨膜是校准了校准了羟基磷灰石幻影的50个标本扫描仪。简而言之，将样品固定在10％磷酸盐缓冲的福尔马林中，并在70％乙醇中扫描。使用10 mm的素尺寸和X射线管电位为55 kVp，X射线强度为109 µA进行扫描。扫描的区域包括股骨近端的2 mM区域，股骨旁骨和股骨中部1毫米区域。在70 kV，57 µA，4 W时以10 µm的分辨率进行扫描的股骨，积分时间为700 ms。皮质和小梁骨的分析阈值为0.8 sigma，1个支撑和260（下）和1,000（上）封闭。使用Scanco评估软件评估了感兴趣的卷。使用Scanco Medical MCT Ray（V.4.0）软件创建代表性3D图像。 　　在安乐死前7-9天注射小鼠，在安乐死前2天注入20 mg kg-1钙调蛋白（Sigma-Aldrich），在安乐死前7-9天注射小鼠。将骨骼固定在4％PFA中，在30％蔗糖中脱水，并嵌入OCT或嵌入MMA塑料中。使用Cryojane Tape Transfer System使用Microtome（Leica CM1950）切割标准的未定资格的部分（5 mm）。使用FITC（Calcein）和Texas Red（Alizarin Red）通道将固定的部分用回声旋转R4成像。在远端类中的继发海绵中建立了一个2.5 mm2面积的标准采样位点。在组织分析之前，用齐iss Axioplan成像仪M1显微镜（Carl Zeiss显微成像）以带有机动阶段的形式以×20的放大倍率获取远端股骨的镶嵌图像。在使用两个图像分析软件程序进行盲目分析之前，使用Axiovision软件（Carl Zeiss Microimaging）对瓷砖图像进行了缝合，并使用Axiovision软件（Carl Zeiss微成像）转换为单个图像：生物征 - 骨或ImageJ。The following variables were analysed: %BV/TV, mineral apposition rate, mineral surface/bone surface (MS/BS), bone formation rate/bone surface (BFR/BS), osteoblast number/bone surface (No. Ob/BS), lacunar density (N Lacunae/BA), TRAP-positive osteocytes (%), and osteoclast number/bone surface (No. Oc/BS).将相邻的部分用艾丽莎白红色染色，以概述明亮场图像。 　　将股骨或胫骨样品固定在4％PFA中，并在10％EDTA中脱矿于10-14天，然后嵌入MMA塑料中。使用Leica RM2165切割切片（5 µm），然后用山马妥毒素和曙红（H＆E）染色或用陷阱染色。Photoshop软件删除了非组织区域的背景，以示近端胫骨图像。皮质骨细胞的硝酸银染色是在未降低的冷冻股骨的切片上进行的。简而言之，在拆除OCT后，将切片在室温下在10％EDTA中孵育1小时。随后，将带有切片的载玻片在硝酸银 - 胶质素溶液中孵育，使用50％w/v硝酸银的2份和1部分2％明胶在1％甲酸的情况下，在室温下55分钟，然后进行2分钟的水洗。然后将切片在5％硫代硫酸钠中孵育10分钟，然后再进行2分钟的水洗步骤。成像脱水的切片，受盖玻片保护。图像用于计数定义的皮质区域中的骨细胞。 　　BMAT的量化遵循已发布的协议32。简而言之，在14％EDTA，pH 7.4中将股骨脱钙了2周，然后与含有1％四氧化osmim osmium osmium osmium osmium osmim Sciencopicy Sciences Sciences 19170）和2.5％二甲甲酸钾（Sigma-Aldrich 24-4520）的PBS溶液一起孵育48 h。用水洗涤2小时后，将骨染色的骨头嵌入2％琼脂糖中，然后用Scanco µCT 40扫描仪以10 µm Voxel分辨率进行扫描。将目标区域进行了轮廓和分析，以400的阈值进行BMAT定量。具体而言，将远端类冲突中生长板高于生长板的2 mm区域用于定量股骨中调节的BMAT。 　　股骨使用机械载荷框架进行了三分弯曲测试（Instron E100or Enduratec，ELF3230）。7毫米的跨度将下部支撑分开以支撑样品的两端。测试头在支撑之间的中点处对齐。将股骨预加载到1 N的力，然后以0.1 mm S – 1的速率加载。在机械故障后终止加载，每0.01 s收集力量降至0.5 N。所有测试均在室温下使用上述机电负载框架进行。 　　在肌肉分散和the骨的横向脱位后暴露了麻醉小鼠的股骨。在股骨con中插入了25规针针，以提供相对的髓内固定，然后使用微弹药产生横向，横向分裂骨折。然后立即将水凝胶放在骨折部位。重新定位the骨，并使用6-0尼龙缝合线（Ethicon）重新染色肌肉。手术后21天对小鼠安乐死，解剖骨折的股骨，并去除髓内引脚进行后续分析。对于水凝胶制造，将八臂聚（乙二醇）乙烯基磺酮（PEG-VS）（10 kDa）（Jenkem）溶解在2倍浓度的HEPES（25 mm，pH 7.2）中。将鼠重组CCN3（R＆D系统）添加到前体溶液中，以达到每个水凝胶1或2μg的终浓度。没有生长因子的水凝胶作为对照，并带有相等体积的HEPE。GPQ-A（GCRDGPQGIAGQDRCG，Genscript）是一种可蛋白酶 - 可裂解的交联肽，以1：2的体积比与PEG-二硫醇（PEG-DT）（3.5 kDa）（3.5 kDa）（Jenkem）（Jenkem）（jenkem）混合，以中等（ph8.3）的浓度（pH8.3），以允许Metrix MetRix Metallopase 5。将前体溶液以1：1的体积比混合，然后将其移到硅胶模具上，最终体积为每种水凝胶6μl。使用SkysCan1276（Bruker临床前成像）扫描断裂老茧，并具有上述设置，并通过在断裂位点的两个方向上选择50个部分进行分析，从而产生100个部分的总面积。为了分析愈伤组织矿化，使用CTAN软件来选择跨越髓内空间外裂缝愈伤组织区域的感兴趣区域，不包括皮质骨组织。 　　简而言之，从前细胞的静脉中收集了300 µL的全血，并从前胞脂ESR1FL/FL和ESR1NKX2.1-CRE雌鼠中收集到EDTA处理的管（Microvette cb 300 k2e）中，并将其直接放在冰上。为了分离血浆，在4°C下以2,000克的旋转为2,000克，并收集上清液。收集了10-11周龄的女性和雄性小鼠（ESR1FL/FL）的左右股骨，并用软组织清洁。在全骨测定中还测试了从国家衰老研究所提供的18个月大的雌性小鼠（菌株C57BL/6）收集的股骨。立即将左股骨固定在4％PFA中，然后在4°C下转移到PBS中，以进行组织学评估以获得基线测量。将右股骨培养在含有1.4 mL原代培养基（α-MEM；含有谷氨酰胺和核苷的核苷； Mediatech）的12孔板中，补充了10％FBS（亚特兰大生物学）和100 U ML – 1 Pericillin-1 Pericillin-streptheptycin（Mediatiatech）。The left and right femurs were treated with 15 µl of plasma from Esr1fl/fl and Esr1Nkx2.1-cre females, respectively, or with mCCN3 (14 µl of 0.0125 µg µl–1 of recombinant mCCN3, 1976-NV-050, R&D Systems in 1.4 ml of primary culture medium) or with vehicle (14 µl of 0.9% normal saline in分别为1.4毫升的原代培养基）。为了评估培养过程中整骨的降解，将右胫骨或股骨在培养基中培养为14 µL 0.9％的正常盐水5天（盐水）。将这些与基线对侧股骨进行比较，股骨立即冷却并固定在4％PFA中进行分析（基线）。每天进行包括等离子体，MCCN3或车辆处理在内的中等变化。培养5天后收集股骨，固定在4％PFA中，然后在µCT成像之前在4°C下转移到PBS中。µCT成像后，如下所述，对股骨进行了组织学处理。 　　将股样样品清洗，用软组织清洁，固定在4％PFA中，并在嵌入石蜡中嵌入10-14天的10％EDTA中脱矿。然后使用Leica RM2165切割，然后用Movat的Pentachrome染色试剂盒（ABCAM，AB245884）切割5 µm的切片。对于H＆E染色分析，收集股骨，固定在4％福尔马林中，在CAL-RITE中脱钙，在30％的蔗糖中脱水，并在OCT中嵌入。然后，使用Microtome（Leica CM1950）切割5 µM标准部分。 　　如前所述，制备了肝蛋白裂解物。如上所述分离血浆，CCN3蛋白通过肝素 - 琼脂糖亲和纯化富集58。洗涤肝素 - 琼脂糖珠（Sigma，H6508；每个样品200 µL），并在PBS中平衡具有蛋白酶抑制剂（Thermo，78425），并与等质量等于1 mg的总蛋白质，并在4°C下孵化为恒定旋转。然后用PBS将珠洗涤四次，并通过将珠子煮沸10分钟在含有50 mM dithiothreitol的Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad，1610747）中洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE分离肝（10 µg）和亲和纯化的血浆蛋白，并转移到硝酸纤维素膜（Bio-Rad，170-4270）中。通过Ponceau的染色评估蛋白质负荷水平（Thermo，A40000279）。用5％正常的驴血清（ABCAM，AB7475）对TBS-T（0.1％Tween 20）的膜进行去除并阻塞。然后用抗CCN3抗体（R＆D Systems，AF1976; 1：3,000）在4°C下在4°C下探测印迹，并在5％血清的TBS-T中进行。用TBS-T洗涤后，将印迹与HRP偶联的二抗（Invitrogen，A15999; 1：30,000）在室温下孵育1小时，在TBS-T中洗涤，用化学发光底物（Thermo，34577）和Imaged（Azure BioSosystems）孵育。 　　根据制造商的协议，使用以下探针使用RNASCOPE（ACD，多重荧光V2）进行荧光免疫组织化学：CCN3（ACD，415341-C2），ESR1（ACD，478201），PENK（ACD，ACD，318761）和ACD，ACD，ACD，50000141-1）。 　　使用针对ERα的一抗（EMD Millipore，C1355多克隆兔，1：750稀释），CCN3（R＆D Systems，AF1976多克隆山羊，1：1,000稀释），进行免疫组织化学进行免疫组织化学。AB19028多克隆兔子，1：200稀释）在PBS中稀释为0.1％Triton-X100，5％正常驴血清和5％BSA。为了检测，将切片用适合物种的二次Alexa荧光偶联抗体（Invitrogen，A-21447，A10042或A-11055; 1：1,000稀释）标记。使用钥匙BZ-X800宽场荧光显微镜对载玻片进行成像。使用EMCCD摄像头和微管理器（V.2.0gamma）的尼康CSU-22在UCSF尼康成像中心获取共聚焦图像。使用ImageJ Fiji（V.1.52i）和单元格插件（V.2）对图像进行处理和量化。选择了每个样本的三个代表性观点。补充表2列出了免疫组织化学分析中使用的所有抗体的完整列表。从固定4％PFA中收集的冷冻切片（20 µM）用于荧光免疫组织化学和免疫染色。 　　将小鼠固定在立体定位框架（1900型，David Kopff乐器）和400 nl CCN3或非靶向siRNA池（Dharmacon，E-040684-00-0010或D-001810-10-10-10-10-05，0.4 mm）中，以下是均匀的1个coordy coordy coordy：ML：Bregma±0.25 mm，DV：颅骨-5.9毫米。对于SHRNA研究，将雌性小鼠双侧注射（每侧200 nL，2.53×1013 GC ML -1），并允许在与雄性小鼠交配之前恢复10-14天。注射后12天（siRNA）或12 DPP（shRNA），雌性小鼠安乐死，并如上所述收集并处理脑和骨样品。然后，如上所述，通过µCT成像分离的股骨，以进行骨移植测定。由于突变雌性小鼠的高骨表型，在不同的实验之间调整了阈值和感兴趣的选择区域，但在每个实验中保持一致。 　　对于重组CCN3，每天将重组MCCN3（I.P.，7.48 µg kg – 1; R＆D Systems，1976-NV-050）或车辆对照（i.p.，0.9％正常盐水）每天注射10周大的对照雌性和13周龄的雄性小鼠（ESR1FL/FL）（ESR1FL/FL），每天注射重组MCCN3（I.P.，7.48 µg kg – 1; R＆D Systems）。在安乐死前七天，首先将小鼠注射20 mg kg-1钙调蛋白（Sigma-aldrich），然后在安乐死前2天注射alizarin（Sigma-Aldrich）的15 m kg – 1。将右股骨清洗为软组织，固定在4％PFA中，然后在成像之前将其存储在4°C的PBS中。如上所述，通过µCT扫描对骨移植测定进行成像。成像后，然后对股骨进行处理，以进行H＆E组织学和动态组织形态计量学，如上所述。对于S961治疗，将10周龄的ESR1FL/FL和ESR1NKX2.1-CRE雌性小鼠注入连续S961（每渗透泵70 nm），一种胰岛素肽受体拮抗剂，是从先前的研究中改编的，并从先前的研究中得到了改编，并通过Novo Novo Novo Novo Novo nover Nover Nodist Solution Anting ANCOTOY ANIE ANCETION ANCETION ANCETION ANCETION ANCETION ANCETION ANCETION ANCETION ANCETION ANCERIS ANCERIS ANCONIE OSMERZ OSMIN9661或NNC0061或0969）或（1004型），4周后一次交换了一次，总输液期为8周。S961以0.9％的正常盐水重组。将迷你渗透泵植入异氟烷麻醉下的X型皮下皮下袋中，并交换一次。对于纳洛酮治疗，将10周龄的ESR1FL/FL和ESR1NKX2.1-CRE雌性小鼠注入连续纳洛酮，连续纳洛酮，一种非选择性阿片类拮抗剂（每24小时0.5 mg/24 h，在4周内每24小时，TOCRIS，TOCRIS，TOCRIS，0599/100）或通过Alzet Mini Milsotototo pumpor（型号1004）。在含有0.9％正常盐水的车辆溶液中重构纳洛酮。在异氟烷麻醉下将迷你渗透泵植入X型皮下皮下袋中。 　　使用具有高肝曲皮抗体的AAVDJ病毒载体可实现MCCN3蛋白的异位肝细胞表达59在组成型巨细胞病毒的控制下编码小鼠CCN3立即进行了巨细胞病毒，即立即促进的增强剂/鸡β-肌动蛋白（CAG）启动子（CAG）启动子（Vector Biolabs，Aav-265959595959595959595959595959595959595959595959595959595959595959595959）。首先在无菌盐水中稀释病毒载体，并将对照（ESR1FL/FL）小鼠注射为100 µL的0.5×1010、3×1010、3×1010或15×1010 GC的AAVDJ-CAG-CCN3或阴性对照。2周后，对每组的一只动物安乐死，并使用抗CCN3抗体进行了肝脏的表达，如补充表2中所示。5周后，将小鼠安乐死，骨，血浆，血浆和肝脏收集。将肝样品分开并分别处理，以分析通过免疫组织化学通过qPCR或CCN3蛋白表达CCN3 mRNA表达。通过苯酚 - 氯仿提取分离总肝RNA，并使用RNeasy Mini Kit纯化（Qiagen，74104）。如下所述进行QPCR。对于免疫组织化学，将肝脏样品在4％PFA中掉落，冷冻（10 µM）和如上所述染色的抗体。清洁孤立的股骨，然后如上所述进行骨移植测定。 　　使用视觉CHIASM作为参考点，从对照和突变的雌性小鼠（1-27周龄）中获得了微分解的弧或内侧下丘脑组织，并用基质切片机分离出2 mm的组织含量。对于ARC，使用RNA迷你试剂盒（Invitrogen）纯化总RNA。对于qPCR，使用应用的生物系统高容量cDNA逆转录试剂盒合成cDNA。使用SYBR绿色进行表达分析。将值标准化为36B4或MCYCLO。补充表1中提供了引物对的序列。 　　对于批量RNA-Seq分析，使用Nebnext Ulta ultra II RNA库预备套件制备了条形码测序文库，用于质量检查后的Illumina，并在Illumina的Novaseq 6000，S4 Flow Cell上进行测序。Novogene采取了这些步骤。对于所有组织样品，使用Kallisto在Gene Mode60中使用Kallisto将测序生成的读取与小鼠转录组（MM10）对齐。使用Sleuth（Qval <0.05）61评估了差异基因表达。所有热图都是从27周龄小鼠获得的前50个女性/男性偏见基因产生的，并在R62中产生。 　　如上所述，使用处理和流式细胞仪方案通过FACS分离了4周龄ESR1FL/FL和ESR1NKX2.1-CRE长骨的单个OCSSC。Single-cell suspensions pooled from four mice per group was used, and individual cells were captured in separate wells of a 96-well plate containing 4 µl lysis buffer (1 U μl–1 RNase inhibitor (Clontech, 2313B)), 0.1% Triton (Thermo Fisher Scientific, 85111), 2.5 mM dNTP (Invitrogen, 10297–018), 2.5 μMoligo dT30VN (IDT, custom: 5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′) and 1:600,000 External RNA Controls Consortium ExFold RNA Spike-In Mix 2 (ERCC; Invitrogen, 4456739) in nuclease-free water (Thermo Fisher Scientific, 10977023) according to a modified Smart-Seq2协议54,63。每个表型的两个96孔板，每个孔单孔单个OCSSC进行分类和处理。盘子向下旋转并保持在-80°C，直到cDNA合成为止，使用SmartScribe逆转录酶（Clontech，639538）和含有锁定的核酸含有模板 - 开关寡头核苷酸（Exiqon，exiqon，Custic：exiqon，exiqon，exiqon，exiqon，exiqon，exiqon，exiqon，exiqon，exiqon，exiqon：5'-AAGCAGTGGTATATATACACGCAGAGTACATRGRG+G-3'）。使用KAPA HIFI HOTSTART REDYMIX（KAPA BIOSYSTEMS，KK2602）进行PCR扩增，并使用原位PCR引物（IDT，自定义：5'-AAGCAGTGGTGGTGGTGGTATCA-ACGCAGAGAGT-3'）进行。然后用Agencourt Ampure XP珠纯化放大的cDNA（Beckman Coulter，A63882）。定量后，将来自每个孔的cDNA标准化至所需的浓度范围（0.05-0.16ngμl-1），并通过稀释并固结到384孔板中。随后，使用半自动化管道，将此新板用于库制备（Nextera XT套件； Illumina，FC-131–1096）。按照Nextera XTS方案（Illumina）建议，使用两轮（0.35×和0.75×）的Agocourt Ampure XP珠子（Beckman Coulter）进行了汇总，清理和尺寸选择的条形码库，并进行了尺寸选择。。高敏性碎片分析仪运行用于评估碎片分布和浓度。在NovaseQ6000（Illumina）上对汇总的库进行了测序，以获得1–200万个2×151个基本对配对末端读数。 　　使用BCL2FASTQ2（v.2.18; Illumina）对测序数据进行反复。使用串串进一步处理原始读取，以进行3'质量修剪，3'适配器修剪和去除变性读数。然后使用Star（V.2.4）将修剪读数映射到小鼠基因组（V.M20），并使用RSEM（v.1.2.21）计算基因和转录本读数的计数。探索了数据，并使用Scanpy（V.1.9）生成图。为了选择高质量的细胞，我们排除了少于450个基因的细胞，而在少于三个细胞中检测到的基因被排除在外。线粒体基因含量高于5％的细胞，ERCC含量高于30％，核糖体基因含量高于5％。然后，使用scublet检测和删除残留的重复项。最终分析中包括总共264个高质量细胞（122个对照和142个突变小鼠细胞）。原始计数百万（CPM）值是均值归一化和对数正归化的，然后将数据缩放到最大值为10。战斗批次校正被应用以通过细胞处理中的微小差异来考虑潜在的偏见。主成分（PC）“肘”启发式方法用于确定使用UMAP和Leiden算法（Leidenalg）聚类分析的PC数量。使用Wilcoxon rank-sum检验计算了ESR1FL/FL（WT）和ESR1NKX2.1-CR（突变体）以及Leiden簇之间的差异基因表达。富集用于探索WT和突变组之间DEG的途径和本体学的富集64。 　　使用Prism 10（GraphPad）进行了不包括RNA-Seq分析的统计检验。补充表3中提供了测试和结果的描述。使用每个图传说中所示的事后测试对单向，双向和重复测量方差分析进行了多重比较校正。对于主要数字和扩展数据数字中的所有面板，n表示所使用的生物样本量，n表示细胞培养分析中的技术重复。使用Grubbs检验（α= 0.05）鉴定出离群值。除非另有说明，否则数据表示为平均值±S.E.M.或盒子图，其中晶须代表最小值和最大值，框的边缘为25个百分位和第75个百分位，中心线表示平均值。样本量基于我们实验室的先前工作；但是，未进行特定的统计计算以确定样本量。对于AAVDJ-CCN3和siRNA注射，从同窝层池随机抽取了相同基因型的小鼠，以接收功能或对照病毒注射。对于所有随后的µCT和动态组织形态计分析，对正在研究的小鼠接受的AAV类型和基因型视而不见。在样本登录号GSE248882和GSE241478的基因表达式Omnibus（GEO）中，所有原始数据和处理的批量RNA-seq和Scrna-Seq的处理数据文件均可公开获得。补充表1中提供了本研究中使用的试剂列表。从生物学家（https://www.biorender.com）复制或改编1B，2B（肾脏），5C和6J（乳房，骨骼和钙）。图2中的图形。在创意CON CON CC BY-SA 4.0下，将1G，2B（鼠标）和6J（鼠标）和6J（大坝和垃圾）复制或改编。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。