人体免疫系统的物理接线图

　　人类胚胎肾脏293（HEK293）细胞在悬浮培养物中以自由式培养基（Gibco 12338018）的含量保持在37°C，5％二氧化碳和70％的湿度，并在37°C下补充1％热灭活的胎牛血清（Sigma F2442）。对于所有瞬时转染，在转染之前24小时以每毫升2.5×105细胞的密度接种细胞，然后按照先前所述的46用每ML细胞0.5 µg DNA转染。蛋白质表达在排气圆锥烧瓶（康宁）中进行，范围从主要筛选的30 mL细胞到其他应用的100 mL细胞。细胞结合测定法的转染通常在96孔深板中的1 mL细胞中进行（康宁3960）。如果要以生物素化为酶，则将培养基添加到100 µM中，将培养基补充为100 µM，并且编码分泌的Bira Biotin Gigase的质粒以每ML细胞30 ng共转染了分泌的BiRA生物素连接酶。使用编码这两个链的质粒的等摩尔比进行的蛋白质复合物（例如整联蛋白）的转染，除了与HLA相关的复合物外，只有10％的总质粒编码的β2微球蛋白。对于大多数实验，使用含EBNA1的HEK293-E细胞系，除了用于次级结合筛选的蛋白质，该蛋白在无血清修饰的HEK293-6E线条中表达。两种细胞系均由Y. Durocher提供。定期测试细胞系的支原体（萨里诊断），并被发现为阴性。 　　将转染的细胞孵育范围为90至120小时，将它们以2,000g离心20分钟。通过0.22 µM过滤器过滤上清液，并通过镍离子亲和色谱法纯化，确切的过程与预期的下游实验略有不同。使用先前描述的96位置气动Press49纯化了用于高通量相互作用筛选的蛋白质（GE HealthCare 28-4009-89）纯化蛋白质。在纯化前，将每种上清液补充为16 mm的最终咪唑浓度和250 mm的NaCl浓度，并通过用500 µl纯水冲洗板，并用500 µL 20 mm咪唑咪唑磷酸盐磷酸盐磷酸盐磷酸盐磷酸盐的说明来制备。一旦所有样品加载，将板再次用500 µL 20 mM咪唑磷酸盐缓冲液洗涤两次，并用200 µL 200 mM 200 mM咪唑磷酸盐缓冲液洗脱。如先前所述50，使用装有1 ml Histrap HP柱（GE Healthcare）的äkta纯自动色谱仪器（GE Healthcare）纯化了次级相互作用筛选和SPR的蛋白质。用Hispur Ni-NTA树脂（Thermo Fisher Scientific 88221）手动纯化用于基于细胞的实验的蛋白质。在20 mM咪唑磷酸盐缓冲液中对树脂进行了两次预洗，然后重悬于补充1 mM咪唑的上清液中。将浆料在4°C下孵育过夜，然后在20 mm咪唑磷酸盐缓冲液中进行两次洗涤，并最终在200 mM咪唑磷酸盐缓冲液中洗脱。最初纯化后，使用12–14-kDa分子质量截止D-Tube D-Tube D-Tube D-Tube D-Tube透析器（Millipore 71505），将旨在用于免疫细胞测定的蛋白透析在4°C下透析过夜。旨在用作SPR分析物的蛋白质通过凝胶过滤进一步解决SuperDex 200上的äktaExpress机器的蛋白质，增加10/300 GL尺寸-Exclusion柱（GE Healthcare） 去除任何可能干扰动力学测量值的聚集蛋白。为了避免色谱柱上的降水，将分析物样品预先使用HBS-EP缓冲液（GE Healthcare BR100669）。所有蛋白质均在4°C下储存直至使用。 　　将样品在十二烷基硫酸锂（Nupage NP0007）和二硫代醇（Nupage np0004）中变性，在70°C加热10分钟之前，总体积为10 µL。将样品在BIS-Tris 4–12％聚丙烯酰胺梯度SDS-PAGE凝胶（Nupage NP0329）的200 V中分解50分钟，在MOPS Buffer（Nupage NP0001）中。作为标记，将4 µL的预染色Seeblue Plus2蛋白标准（Invitrogen LC5925）添加到每个凝胶中。对于总蛋白质的coomassie染色，将凝胶短暂冲洗在水中，然后在24-36 h的亮蓝色G-250染料（ABCAM AB119211）中孵育。在可见光下成像之前，将凝胶短暂冲洗两次。对于免疫印迹，将蛋白质转移到转移缓冲液中的甲醇激活PVDF膜（GE Healthcare 10600029）中，在300 mA的60分钟内转移到转移缓冲液（Nupage NP0006）中。Blots were briefly washed in HEP​​ES buffered saline (HBS) with 0.1% (v/v) Tween-20 (Sigma P2287), blocked with 2% (m/v) bovine serum albumin (BSA; Sigma A9647), stained with 1:5,000 anti-His tag C terminus antibody conjugated to HRP (Invitrogen R931-25, clone3d5）在4°C下持续16小时，再洗3次，并暴露于化学发光底物（Thermo Fisher Scientific PI34577）。图像是在45–90 s上在摄影膜（GE Healthcare 28906835）上开发的。为了自动化我们对电泳观察到的分子质量与计算预期质量的比较，我们制作了一个自定义的Python脚本，该脚本使用Biopython库来翻译每个表达式构造，并通过自动查询来识别转换后的加工位点，从而将其转换为Uniprot。 　　在清晰的平底96孔板（Thermo Fisher Scientific 11349163）中制备了从1,200至7 ng µl-1的纯BSA（Pierce 23209）的标准曲线。通常，将20 µL的每个标准曲线和纯化的蛋白质样品添加到板的孔中。所有井都添加了250 µL的Bradford试剂（Pierce 23236），并轻轻搅拌60 s，然后孵育30分钟，然后用Tecan火花板读取器测量595 nm的吸光度。所有原始的吸光度信号在进一步处理之前都具有减去仅缓冲控制的平均背景。标准曲线数据与五阶多项式拟合，其截距固定为（0,0）。在使用多项式方程计算每个样品的浓度之前，对曲线进行了手动检查的拟合和残差。通过使用通过自动Python脚本计算的分子质量将这些值转换为摩尔浓度，但不包括附加的聚糖修饰质量。 　　无论是检查基于布拉德福德的摩尔力计算还是为了确定如何形成细胞染色四聚体，都通过竞争性ELISA对生物素化重组蛋白进行了定量。将靶蛋白的稀释系列稀释在96孔板中，然后与已知常数量子的共轭抗生物素（用于结合测定计算的SAV-HRP，用于细胞结合细胞仪试剂的SAV – PE，用于免疫细胞触发性分析的中性素）的SAV-PE）。在20°C下至少45分钟后，将这些预孵育的样品转移到BSA阻塞的链霉亲和素涂层的96孔板上（Greiner 655990）。再孵育45分钟或更长时间后，用HBS和0.1％（v/v）Tween-20洗涤板3次。原代抗体，通常在100 µl 2％（m/v）BSA的HBS中制备OX68单克隆的1 µg mL -1，在HBS中制备了60分钟，然后洗涤3次。类似地，将山羊抗小鼠IgG与碱性磷酸酶（Sigma A3562）偶联的二抗体在0.2μgml-1中类似地孵育30分钟，然后再进行另一次洗涤。最后，加入二乙醇胺缓冲液中的60 µl 1.5 mg ml-1 p-硝基苯基磷酸盐（Sigma P4744），并在30-60分钟后通过TECAN火花板读取器测量30-60分钟后405 nm的吸光度。 　　以下是用于筛选的最终SAVEXIS技术的过程，这是通过在其开发过程中进行多次迭代后通过对每个测定参数进行广泛优化而确定的。将链霉亲和素涂层的384孔板（Greiner 781990）用80μlHbs用0.1％Tween-20（HBS-T）短暂洗涤，然后在HBS中以2％（m/v）BSA在HBS中（10 mm HEPES，10 mm MGCL2，2mmmgcl2，2 mmmmmmmmmm cacl2，5 mm kcl，140 mm kcl）中阻塞20°C。将纯化的诱饵蛋白在HBS中的2％BSA中稀释，使每个50μl孔都包含100个生物素化蛋白的Femtomoles。使用自定义的Biomek FXP机器人（Beckman Coulter）将所有筛选板从一组库存源板中排列，并手动检查以纠正错过的任何井。将诱饵在4°C下捕获16小时。同时，通过将6.25 FMOL的链霉亲和素HRP（Pierce 21130）与计算出的化学计量等效的25 FMOL重组蛋白混合在一起来组装多聚体猎物。在20°C的新鲜2％BSA中，在新鲜的2％BSA中制备30分钟，然后涂在板上（或在4°C下至少60分钟）。从板上取出诱饵后，将它们在50μlHBS-T中洗涤3次，并补充了0.8μmDesthiobiotin（Sigma D1411），以轻轻阻塞任何无置的生物素结合位点。然后加入每个孔，加入50μl制备的猎物多聚体。在20°C下孵育60分钟后，在HBS-T中另外两次75μl洗涤液在用Desthiobiotin中洗涤，然后在75μlHBS中进行最终洗涤。此后，立即将30μl的TMB发色底物（Millipore ES001）分配并允许在20°C下孵育40分钟。为了在此标准化时间点稳定信号，通过添加30μl的0.3％（m/v）NAF来停止反应（Sigma 201154）。然后在Tecan火花板读取器上测量板，以使其在650 nm处吸光度。然后，自定义R脚本将每个板和井的身份都没有盲目，该脚本将所有测量结果缝合在一起，并将其数字条形码匹配到它们对应的蛋白质。所有洗涤步骤均使用多旋转分配器单元（例如Thermo Fisher Scientific 5840300）进行，并且在两次洗涤之间，将板以10克离心30 s，倒置30 s，并用吸收性填充（Kimberly-Clark 7338）层下方，以拆除所有捕获的气泡。作为对照，每个板至少有一个没有诱饵的孔，一个孔含有标记的诱饵构建体和两个恶性疟原虫p41蛋白的孔，在其上，将其作为猎物呈现的互补蛋白p12的稀释液作为阳性对照添加为阳性对照52。 　　在染色前，将HEK293-E细胞用全长的人cDNA表达构建体（ORIGENE）暂时转染了42-46小时。将90微晶的细胞转移到U底96孔板（Greiner 650161）中，然后在110 µL DPBS中在冰上洗涤（Hyclone SH30264）。将细胞在300g下离心3分钟，除去上清液，然后重悬于生物素化重组蛋白的四聚体中，与R-磷酸coerythrin偶联链霉亲素复合（Biolegend 405245）。通常，使用了一系列四个四聚体量，范围从30 pmol到1 pmol的100 µL DPB的体积（包括约1毫米钙和镁离子），含1％BSA。在用DPB洗涤之前，将细胞与四聚体在冰上孵育45分钟。洗涤包括用另外150 µL DPB盖上每个井，离心，重悬于250 µl冷的DPB中，然后再次离心以除去上清液。在对LSR Fortessa流式细胞仪（BD）进行分析之前，将细胞用1％BSA重悬于100 µL DPB中。如前所述46，记录的事件是通过尺寸进行门控大小的，并使用FlowJo软件（V.10.6.1）删除双重散布和侧面散点轮廓。通常，每种井条件收集了约20,000个封闭事件。 　　如前所述53，动力学和平衡测量均在BIACORE 8K SPR仪器上进行。将生物素化的蛋白配体固定在链霉亲和素涂层系列的S盖片（GE Life Sciences 28920234）上，至大约200个响应单元或最接近的可实现水平。仅将标记的阴性对照固定到大约等摩尔水平。在通过尺寸排斥色谱纯化的24小时内，以每分钟100μl注入分析物以得出动力学数据，或以每分钟20μl的速度进行平衡测量。在HBS-EP缓冲液（GE Healthcare BR100669）中在37°C下进行实验。测试了一系列稀释分析物以及至少一个浓度重复的浓度以检查一致性，并作为一个仅缓冲循环作为阴性对照。使用制造商的评估软件（v.1.1）分析响应轨迹。响应单元是参考提取的，使用默认参数拟合传感器数据。 　　通过克隆和基因合成的组合组合，用于重组表达的完整构造库是组装的。对于克隆的序列，通过PCR通过底漆描绘细胞外域的PCR扩增cDNA模板（Origene）。引物引入了Noti和ASCI限制位点上的悬垂，这使得连接到适当的矢量主干。通过Sanger测序验证了所有合成生产的所有组装插入物。未从现有DNA模板克隆的构建体被订购为合成DNA（Twist Biosciences和Thermo Fisher Scientific Geneart）。合成的密码子被优化用于人类细胞表达。最佳Kozak共有核苷酸序列都包括在所有构建体中，偶尔需要将内源性信号肽的第二个氨基酸突变为丙氨酸。准备使用MIDIPREP或MAXIPREP试剂盒（例如Invitrogen K210007），准备质粒以转染级数量。 　　血液免疫细胞的细胞表面蛋白质组由两个来源定义。首先，对静息和激活状态中28个白细胞种群的先前高分辨率蛋白质组学调查的完整数据集（对于44种细胞类型和状态，涵盖所有主要类别）1与先前确定的人类基因组中每个细胞表面蛋白的手动策划清单合并。手动审查了细胞表面蛋白质组列表，以验证每种蛋白质没有出版物来测量其本地化，这与细胞表面的存在相矛盾。不管表达计数的低点，都包括在内的每种蛋白质，除了高度多态蛋白（例如HLA-A）外。其次，我们在第10个人类细胞分化分子研讨会上添加了所有带有指定CD编号的蛋白质56。手动检查了这些蛋白质的氨基酸序列和拓扑57，以确定细胞外区域以及蛋白质所属的结构类别（以I型单频道/GPI锚定，II型II型单通气，多通，多通，多通和蛋白质，可作为OMBITATIES DIMERS（如整合素）起作用）。排除了信号肽加工后至少20个氨基酸的单个连续外区域的蛋白质。同样，将具有明确连续的细胞外域的多通蛋白排除在与我们的重组表达系统不兼容的情况下。通过Twist Biosciences或Thermo Fisher Scientific Geneart作为合成DNA序列产生构建体，从而优化了人类细胞表达的密码子。如前所述，将蛋白质克隆到与预期拓扑相匹配的PTT3表达载体中。具有N末端细胞外结构域的单通蛋白在发现良好或信号P的信号肽的情况下保留其内源性信号肽。否则， 插入了基于小鼠KAPPA抗体分泌序列的外源信号肽。具有N末端结构域的蛋白质具有附着在其C末端的标签，而倒置设计用于II型C末端蛋白58。所有蛋白质均以融合为融合，该融合物具有大鼠CD4的结构域3和4的重组连接器，代替原始的跨膜序列（称为RCD4）59，以及用于共价修饰的生物素接受者位点，以及用于纯化的纯化标签，以进行纯化的纯化。就蛋白质而存在的蛋白质，包括整联蛋白，与HLA相关的分子，CD1，CD8，GPIB，GPIB，CD79和CD94家族NK受体受体，我们依靠先前确定的设计，其中一条链缺少任何标签，因此将其纯化为完整的复合物，尤其是在标签链中，尤其是该链的纯化，尤其是在其本身不属于链的情况下。由于分子间的二硫键键，包括TNF-Superfamily CD27和HVEM三聚体或B7-家庭ICOS和CD28二聚体，具有固有的多中间能力的蛋白质被完整地表达并允许在细胞分泌后形成功能性复合物。 　　Savexis屏幕中的诱饵与猎物的原始吸光度值的矩阵是通过双向中间抛光剂处理的。将两个单独的筛选阶段分开处理，然后组合以去除每一相批处理效应。将每个蛋白质对的中值信号汇总在两个诱饵 - prey方向（或在同粒相互作用的情况下增加一倍），然后所有相互作用的所有相互作用至少在次级筛选中选择了至少1.0的信号，以在次级筛选中重新测量，除了在初级屏幕中产生高度可变信号的蛋白质。来自次级和初级屏幕的中位数信号通过加权和合并，该加权总和比高通量主屏幕测量值高三倍。然后在验证分析中随后在至少一个方向（使用我们的ROC分析识别的32个相互作用，总计32个相互作用，总计32个相互作用）中产生明显可重复的信号的蛋白质。我们排除了与屏幕上高度混杂的蛋白质的相互作用。也就是说，在排名前1,000对的交互对中出现超过20次。其中大多数具有已知的机制来解释其缺乏特异性，例如已知的凝集素。我们在指导未来筛查结果的解释中经常复发的蛋白质清单可能很有用，因为我们注意到，其中许多（例如，CLEC受体，某些CEACAMS，NRP1，NRP1，IGF2R，FGFRS和LDLR）也经常据报道在其他出版研究的背景下也具有粘合师。 　　在我们的免疫文库中涉及蛋白质的相互作用是在三步过程中系统地编译的。首先，在免疫表面分子的已发表的参考手册中检查了每种蛋白质，以查看是否要求任何相互作用61,62。其次，对于每种蛋白质，其名称和适用的同义词是在Google和PubMed中使用标准化搜索词进行搜索的 <“protein name” AND (binding OR interaction OR affinity)> 和 <“protein name” AND (SPR OR kinetics)>。最后，评估了现有的数据库，包括CellphonedB，Intact，PCDQ，Biogrid，Omnipath和其他已发布的列表63,64。通过确定每个索赔背后的原始出版物，可以手动验证通过这些方法确定的索赔。仅包括可提取实验结果支持的相互作用。在此过程中，删除了这些数据库中的假阳性，例如基于鼠标实验的常见虚假声称的相互作用，这些相互作用被证明在人类中不保存，数据库映射蛋白质名称的错误，考虑到单个基因而不是功能性表面蛋白质复合物而引起的问题，或者是由后期的研究拒绝了一项研究的互动蛋白质复合物，或者拒绝了一项研究。无论单体结合亲和力的定量测量都可以从原始论文中提取。在本手册策划的过程中，也记录了论文中提到的其他相关结果，包括相互作用测量是否给出了明显的负面结果。 　　根据文献的详细手动策划得出的参考集，对来自阵列屏幕的处理结合信号进行了基准测试。正面参考集的定义为文献中与主张的每一次相互作用，或更严格地将其作为通过定量方法（例如SPR，分析性超速离心或放射性标记）或共晶体结构（例如X射线晶体学或低温电子显微镜）进行验证的每个主张。阴性参考集基于实验测量的负相互作用，或者通过按照先前推荐的11个定义随机阴性参考集。11。使用R中的PRROC软件包计算了ROC和Precision-Recall曲线。对于这些ROC和Precision-Recall曲线，将筛选中位数的吸光度测量值转换为“二进制分类”的“相互作用”或“不相互作用”的二元分类。曲线下的面积（AUC）被报告为屏幕性能的总体摘要。在主要数字中计算分类性能时，仅考虑具有重组表达的可检测证据的蛋白质。 　　由于我们的蛋白质 - 蛋白质相互作用网络在很大程度上代表了细胞之间会发生的分子连接，因此我们集成了相互作用矩阵，以识别哪些细胞表面蛋白与表达数据相互结合，以识别不同细胞上存在哪些细胞表面蛋白。表达数据包括来自大量免疫细胞类型和单细胞RNA数据集的蛋白质组学。我们通过表达数据集中的所有可能的细胞类型对进行迭代，并在这些细胞类型对之间的绑定数据集中识别出相互作用的所有对蛋白对。由此，我们创建了一个主数据密钥，该密钥列出了所有细胞对之间所有检测到的分子相互作用。手动验证了与交互网络文件中使用的UniProt配件的基因标识符映射，以确保没有错误或遗失值。从细胞 - 细胞相互作用的完整列表和介导它们的分子的完整列表中，我们可以通过使用表达值或检测到的相互作用的二进制列表来执行定量或定性分析。对于二进制，通常以重复百分比（用于散装数据集）或单元格（对于单细胞数据集）的形式表达基因或蛋白质表达矩阵，其中该单元类型中可以检测到表达。然后，可以通过设置最低阈值（即，对于大多数批量数据集，在至少大部分重复中检测到表达；对于单细胞数据集检测到的表达方式，就可以通过设置最低百分比的阈值来标准化表达的二进化；或者是单细胞数据集检测到的表达，在10％检测中是阈值的共同先例54,65）。当将患病与对照组织样品进行比较时，将对对照和疾病表达数据分别重复此过程，然后在每种相互作用中根据这些标准在一个标准中被检测到，无论是否以一个标准检测到它，都可以确定或两种情况。所有整合均在R中进行。 　　单细胞RNA序列（RNA-SEQ）数据集38,66,67,67,68,69,70使用Python（v.1.4.5）71中的Scanpy软件包进行了标准数据清洁管道后处理。所有来自线粒体序列的读数中有超过10％的细胞被去除，最少至少200个基因或最多超过3,000个基因的细胞也被去除。未考虑在少于两个细胞中检测到的基因。从原始发表的研究中获取的细胞类型标签始终保留。在先前描述的管道66,72之后，在露天聚集在前1,000个高度可变基因上后，手动注释了骨髓数据集中的细胞类型。随后的分析中未包括少于10个细胞的细胞类型簇。对于Circos风格的地块，使用ShinyCircos软件包显示集成的单细胞RNA和相互作用矩阵数据。绘制了Circos风格的链接，其中两种细胞类型在阈值上方表达了相互作用的细胞表面蛋白对，需要在细胞型簇中至少10％的单个细胞，以至少对表面蛋白的读取至少一个mRNA。为了可视化，未显示无处不在的交互作用，但是用户可以在我们的交互式网站上探索不同的可视化标准。使用R（V.1.0.0）中的Nichenet软件包进行了信号分析，并使用本手稿中使用的所有默认模型构造的所有默认设置在本手稿中构建的配体 - 键入矩阵，没有参数优化26。使用非参数Wilcoxon秩和测试使用Seurat软件包（v.3.1.5）73进行患病和配对参考组织之间的差异表达测试。应用了全基因组多重测试校正。 　　在激活状态和静息状态下具有蛋白质组学测量的细胞类型用于差异表达计算。R中的DESEQ2软件包用于模拟表达计数并计算WALD测试统计74。从这些结果中，通过设置大于2的倍数变化阈值来确定免疫激活后差异表达的细胞表面蛋白的集合。或者，我们还使用调整后的P值阈值进行比较，这给出了相似的结果（即扩展数据图6）。将每种蛋白质映射到其对其参与的相互作用的测量结合亲和力。对于具有多种相互作用的蛋白质，通过将每种结合相互作用的亲和力作为单独点来解决这种歧义。然后，根据免疫激活后将其相应蛋白上调或下调的每个细胞类型的这些亲和力值分组。韦尔奇的t检验比较了上调和下调相互作用的亲和力。 　　动力学模型的详细信息和方程的派生可以在补充方程中找到。对于要建模的每种血液免疫细胞类型，就汇总了有关其物理几何形状，比例和蛋白质表达的发表参数。When cell types were to be matched with experimental data containing less subtype resolution than the proteomics expression dataset, expression values were estimated as the weighted average of all of a cell type’s constituent subtypes, weighted by their measured proportions in blood (for example, if total CD56+ NK cells were measured in the experiment, the ‘NK dim’ and ‘NK bright’ subtypes measured in the proteomics would be在模型中按比例平均）。通过假设所有蛋白质都存在于大约球形细胞表面上，从表达数据中每个细胞的绝对蛋白计数转化为每个表面积的平均蛋白质密度。通过量化的相互作用，通过Michaelis -Menten方程计算结合蛋白分子的相对平衡密度75。为了确定不同细胞类型的相对连接亲和力，比较了不同细胞对的所有相互作用的总和。 　　尽管核心动力学模型可以计算相对细胞亲和力，但通过公式，它不能自身预测特定的对蛋白质扰动的结果（例如，其通过去除表面蛋白质的预测将在结合中均匀地降低，或者从亲和性增强中的预测会增加）。因此，在做出扰动预测时，根据质量作用定律将相对细胞亲和力作为参数传递给微分方程系统。具体而言，假定所有细胞类型都以恒定的速率碰撞并形成连接，并且该细胞 - 细胞键的分离速率与由核心动力学模型确定的相对亲和力成反比。作为初始条件，假定所有细胞在与人类血液的文献报道值相匹配的频率下都是未结合的。数值整合一直进行，直到达到平衡为止。使用Python（v.1.11）76中的PYSB软件包进行计算。我们最初的扰动研究通过将该蛋白的表达值设置为所有细胞类型的表达值，从而模拟了去除特定的表面蛋白。 　　将表达数据集与交互表集成后的二进制相互作用计数被使用R中的IGRAPH软件包转换为加权的无向网络图（v.1.2.5）。计算图表中每种单元格类型的特征向量中心。每个具有单细胞分辨率数据集可用的组织分别计算出来。为了将髓样细胞群与其他谱系进行比较，我们在中心度指标上进行了双面韦尔奇的t检验。通过Benjamini – Hochberg程序进行了多个组织的P值校正。对于这些和所有其他盒子地块，中央框显示第25％，第50和75个百分位数，晶须延伸到四分位间距的1.5倍。 　　从10倍基因组学下载淋巴结空间转录组数据，并使用Scanpy软件包中的Python中的标准清洁管道进行处理。阵列上测得的斑点被限制为4,000至36,000个总成绩单计数，少于从线粒体序列得出的读数的20％，并且检测到的至少2,000个不同的基因。基因被限制在至少五个斑点中检测到。空间坐标上的150个单位半径在经验上确定，仅包含立即连接的相邻斑点到给定位点的中心，并在确定邻居关系时使用。通过相互作用网络中的所有蛋白质对进行迭代，标记了它们是否可检测到这对蛋白质的单个蛋白质的至少一计，无论是蛋白质还是两项蛋白质。在物理连接的斑点中检测到两种相互作用的蛋白质的实例数量（由于斑点的分辨率如何平均包含一个以上的单元格），在物理连接的斑点（直接邻近的斑点或包含表达两者的单元的同一地点）的数量是相同的蛋白质相同的数量，但同一蛋白质的数量也是如此。为了计算受体 - 配体相互作用中每对蛋白质编码基因的共定位评分，在整个淋巴结组织段中计算了“相互作用”配对的比例（即具有相互作用的相互作用”（即受体和配体的物理相邻表达）。为了测试我们的实验发现的相互作用列表，以随机配对的细胞表面蛋白的无效假设， 我们采用了与真实的相互作用网络中相同的蛋白质，并随机置换了，这些蛋白是配对的。比较了来自文献策划的相互作用列表和我们经验发现的相互作用的分数，比较了该排名无效的分布的共定位得分。统计测试在这三组共定位分数之间首先是单向单向方差分析中的首先组成，然后进行了事后Tukey的诚实显着差异测试。 　　使用干冰冷却的异戊烷在OCT中闪烁新鲜的组织样品，并通过血久毒素和曙红染色检查形态。对于RNASCOPE，将10μmThick厚的冷冻切片切成超冻土加上载玻片，固定15分钟，用冰冷的4％多聚甲醛（PFA）固定，然后在4％PFA的室温下进行90分钟，然后通过乙醇系列（50％，70％，100％，100％和100％乙醇）脱水。然后，使用RNASCOPE 2.5 LS多重荧光测定法（ACD，Bio-Techne）对Lica键Rx系统（Leica）进行蛋白酶III处理的处理进行处理。最初，在对荧光团520，蛋白石570和蛋白石650的探针之前，对rnascope阳性和阴性对照探针进行了测试，以1：1,000的浓​​度进行探针。所有探针先前均已建立，并在目录编号546188-C3（JAG1），845158-C1（VASN），491518-C4（Vista; Vista;也称为VSIR），457368-C1（HLA-E）（HLA-E），460048-C2（460048-C2（460048-C2（PLXNA），4183222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222太平洋上，491518-C4（VISTA；也称为VSIR）（CNTN1），601738-C3（MCAM）和601998-C4（CD45；也称为PTPRC）。然后将它们以20倍的放大倍数成像，并在带有水浸入水中的高含量筛查系统上。 　　根据庞大的苏黎世苏黎世批准的研究方案获得了来自健康供体的血液Buffy coat（苏黎世（Zurich）（Kek Zurich，Basec-NR 2019-01579））。为了获得PBMC，将样品在PBS（Gibco）中稀释1：1，并根据制造商的指示，将细胞用组织帕克-1077密度梯度（Sigma-Aldrich）分离。随后，收集界面上的细胞，用PBS洗涤一次，并重悬于RPMI 1640 + Glutamax培养基（Gibco）中，补充了10％的人血清（Chemie Brunschwig）。将免疫细胞播种并在细胞载体384 Ultra，透明，组织培养物处理的板（Perkinelmer）的密度为2×104细胞的密度为50μl，每孔50μl，并在37°C下孵育，并在37°C和5％CO2中孵育。通过使用伯爵夫人II细胞计数器（Thermo Fisher Scientific）确定细胞数和生存能力。 　　将分离的白细胞与纯化的重组蛋白在中性素（Thermo Fisher Scientific 31000）周围以80 pmol（1.6μm）的剂量为200 pmol（4μm）的纯化的重组蛋白。包括对模拟转染细胞上清液的仅一部仅缓冲液，仅标记的四聚体和洗脱材料的其他阴性对照。将所有新型相互作用且可以充分表达以提供4μM浓度的蛋白质，以及CD209，CD58，ICAM1和SIRPA作为先前表征的对照。测定板是在完全随机的布局中创建的，并由Echo 555液体处理程序制备。每个测定条件进行了四个测定，每种测定中有五个重复，包括4小时和24小时的时间点，有无添加1 pg µl -1 LPS。通过固定和通透性固定和通透性，用20μL的每孔固定和通透性，其中包含0.5％（w/v）福尔马林（Sigma-aldrich），0.05％（v/v）Triton X-100（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich），10 mm sodium sodium（meta）周期（sigma-aldrich）和75 mm-lonosine-lonosine-londo-linosine-noriDe x-100（v/v）triton X-100（v/v），（Sigma-Aldrich）。在室温下孵育20分钟后，通过使用Hydropeed Plate垫圈（Tecan）吸入含固定剂的培养基。然后用补充5％胎牛血清（Gibco）的PBS阻断细胞（每孔50μl），并在4°C下将光漂白4至24小时，以减少背景荧光，通过用常规的白光LED LED板照亮固定细胞。 　　对于免疫组织化学染色，将所有原代抗体在PBS中以6 µM DAPI（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）稀释为核检测。Antibodies used were anti-CD3 Alexa Fluor 647 (BioL​​egend, Clone UCHT1), anti-CD4 FITC (BioL​​egend, clone SK3), anti-CD8 PE (BD Biosciences, clone SK1), anti-CD19 FITC (BioL​​egend, clone SJ25C1), anti-CD56 PE (Beckman Coulter, cloneN901），抗CD16 PE（Biolegend，克隆3G8），抗CD14 Alexa Fluor 647（Biolegend，Clone HCD14）和抗CD20 PE（BD Biosciences，克隆2H7）。每孔，加入20μL抗体鸡尾酒，并在室温下孵育1小时。为了进行成像，使用了PerkineLmer Opera Phenix自动旋转盘共聚焦显微镜，并以20倍放大倍率将348孔板的每个孔用5×5的非重叠图像成像，覆盖整个井表面。这些图像是从明亮场（650–760 nm），DAPI/核信号（435–480 nm），GFP信号（500-550 nm），PE信号（570-630 nm）和APC信号（650-760 nm）通道拍摄的。RAW .TIFF文件被导出以进行分析。 　　使用Cell-Profiler（V.2）77进行细胞检测和单细胞图像分析。通过对DAPI强度的阈值进行核分割。细胞轮廓是通过核从核轮廓的圆形膨胀来估计的。另外，进行了核的第二个和较大的扩展，以测量每个单个细胞周围的局部区域（局部细胞背景）。为每个测得的通道提取了基于标准的细胞生理器的强度，形状和纹理特征，细胞质和局部细胞接近度。如前所述25，对原始荧光强度进行了log10转换并向局部细胞背景进行了归一化。 　　使用MATLAB的神经网络工具箱（V.R2020A）中的48×48×5输入图像实现了具有适应性重新连接体系结构的8级71层深卷积神经网络。对于所有形态学分类器（B细胞，NK细胞，T细胞），使用了具有适应性重新系统结构的2级39层深卷积神经网络（CNN）。使用了48×48×3的输入图像，其中所有图像均包含DAPI和明亮场通道，而第三个通道则包含带有谱系标记的各个通道。在树突状细胞的情况下，使用了所有其他谱系标记。在所有CNN分类中，生成了每个核心中心周围的48×48像素子图像。将距离图像边界的24像素靠近的细胞排除在所有分类之外。如前所述29进行网络培训，评估和分类。 　　为了从图像数据中提取细胞 - 细胞相互作用，使用了先前公开的25方法的简化版本。细胞 - 细胞相互作用分析均在同一孔内的所有不同图像位点进行。如果细胞的核质心在40像素的欧几里得距离内，则将细胞评分为相互作用。为了计算与A型与B型单元相互作用的单元格的相互作用评分，我们首先计算了特定的相互作用和每个孔的总相互作用。我们将特定的相互作用定义为A型细胞周围定义半径内的B型总数的总数。总相互作用被认为是该井中所有相互作用细胞的总数。为了计算最终相互作用评分，将特定的相互作用除以（所有细胞的A型细胞的比例）×（所有细胞的B型B细胞的比例）×总相互作用。 　　对于图形显示，观察到的细胞状态和细胞 - 细胞相互作用频率首先针对其各自的对照进行标准化。将重组蛋白条件与每个相应时间点，剂量和背景免疫激活的对照孔平均的平均值进行标准化。蛋白质控件由仅缓冲模拟治疗井组成，井井的井是通过净化空的转染和仅用蛋白质表位标签刺激的井。如前所述，在药物镜检查实验中，计算正常化为观察到的值减去对照平均值，除以这两个值的最大值，从而从[-1，1]中界定了一个指标，其中0代表相对于对照而没有变化。为了进行统计分析，将所有可用控制条件的原始测量值与Welch的t检验进行了比较与每个相应扰动条件的所有重复。为了调整多个测试，使用了本杰米尼 - 霍克伯格测试，并设定了10％的错误发现率阈值来划定重大效果。这些计算既显示了应用的每种剂量，又显示了给定蛋白质治疗的所有剂量汇总时。对于细胞状态频率和细胞–细胞相互作用数据集都进行了相同的总体分析程序，主要不同的时间点（分别为24 h或4 h）（分别为24 h或4 h）选择了进行集中的统计分析。从所有最终图中省略了非古典CD16阳性单核细胞群体，因为每个实验中检测到的这些细胞中极少数量导致不一致且通常是非有限的效应大小（例如，从0个细胞发现到条件和控制之间发现的1个细胞的变化）。 　　在药物学实验中测得的细胞类型均纳入模型中的微分方程系统中，以确定两个基线细胞 - 细胞相互作用频率，并预测当从模型中取出单个表面蛋白时的变化。通过遵循用于处理显微镜图像数据的相同方程式，将模型计算的细胞频率和所有可能的相互作用的配对配置处理成相互作用得分。从没有背景LPS刺激的4小时时间点的数据用于所有蛋白质条件。由于我们的重组蛋白可以触发或抑制给定的受体途径，因此我们比较了归一化相互作用评分的绝对幅度，以量化扰动程度。在最终分析中，我们限制了蛋白质的集合，仅与该模型预测蛋白质会产生细胞 - 细胞相互作用的有意义变化的蛋白质（定义为模型预测的最大值的最大值，对于中值扰动预测的最大五分之一是我们收集实验性数据的全部蛋白质中最大值的最大值）。根据模型的扰动幅度最大的细胞对与剩余的细胞对形成鲜明对比，这些细胞对被预测在扰动后不会强烈改变。然后进行单方面的t检验，以确定在我们的实验中添加重组蛋白后观察到的相互作用评分的变化是否明显高于我们模型被扰动的细胞对的变化，这是否明显大于所有其他细胞对的基线相互作用评分变化，而这些细胞对的变化是没有预测的。使用Benjamini -Hochberg程序调整P值。 　　剑桥生物座位转化医学（CBTM）从已故的移植器官捐献者那里获得了人类淋巴结，并得到了捐助者家族的知情同意，并获得了英格兰东部NRES委员会 - 剑桥南部的NRES委员会（15/ee/0152）。该同意包括符合Wellcome Trust政策一致的开放式遗传测序数据和出版物的开放式遗传测序数据和出版物的生成。CBTM根据英国人类组织管理局的指南运行。根据庞大的苏黎世统一的研究方案，苏黎世批准了匿名健康捐助者的血液样本（Kek Zurich，Basec-NR 2019-01579）。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。