巨型噬菌体核壳的结构和自组装

　　在30°C下，在硬琼脂（HA）培养基（HA）培养基（HA）培养基（HA）培养基（HA）培养基（10 g-1 Bacto-tryptone，5 g l-1 NaCl和10 g L-1琼脂）在30°C下生长。如前所述，收集了201PHI2-1裂解物2。In brief, 0.5 ml from a dense P. chlororaphis culture grown in HA liquid media (HA medium with no agaradded) was infected with 10 μl serial dilutions of high-titre 201phi2-1 lysate (1011–1012 pfu ml−1), incubated for 15 min at room temperature, mixed with 4.5 ml of HA 0.35% top agar, poured over HA plates, and incubated overnight at30°C。然后，第二天将5毫升噬菌体缓冲液添加到Web裂解板中，并在室温下孵育5小时。通过抽吸收集噬菌体裂解物，通过在3,220克离心10分钟的离心碎片，并将所得的澄清的噬菌体裂解物存储在4°C下。大肠杆菌菌株APEC 2248是从DSMZ获得的，并在37°C的LB培养基中生长。J. Wittmann提供了Goslar裂解物（1010 PFU ML -1），并存储在4°C下。补充表10列出了本研究中使用的所有细菌菌株。 　　Pherd-30T质粒用于表达EGFP标记的全长和chimallin chimallin在P. Chlororaphis22,23中。所有构建体均设计为EGFP融合到N末端，并通过Genscript合成。将质粒电穿孔到叶绿假单胞菌中，并将25μgml -1硫酸庆大霉素用于选择菌落。补充表10列出了本研究中使用的所有质粒。 　　叶绿素细胞（A600 = 0.6的5μl培养物）在井眼载玻片的成像垫上接种。成像垫由1％琼脂糖，25％HA肉汤，25μgml-1硫酸庆大霉素，2μgml-1 FM4-64、0.2μgml-1 DAPI和1％阿拉伯糖诱导表达。将载玻片在30°C下在潮湿的腔室中孵育3小时，并将10μl未稀释的高尊尺为止2phi2-1裂解物添加到垫子中，以在成像之前60分钟感染细胞。使用Deltavision Elite Deonvolution显微镜（应用精度）成像样品。使用Deltavision Softworx Program-V6.5.2中的侵略性算法对图像进行反驳。 　　所有图像分析均在反卷积之前对图像进行。通过测量表示噬菌体核的GFP强度的平均灰度值，使用FIJI确定了平均蛋白质噬菌体结构的平均蛋白质结构，该蛋白质的平均灰度值表示噬菌体核和该环外部的细胞质GFP的平均灰色值。该环GFP的平均灰度与细胞质GFP的比率计算为平均掺入。从每个数据集中选择了代表性的细胞，并在MATLAB 2019a中生成了标准化GFP强度的3D图。使用Prism-v9.3（GraphPad软件）进行统计分析。 　　用空载体或一种嵌合蛋白构建体转化的叶绿素培养物在含有25μgml-1甲基硫酸硫酸盐硫酸盐的HA肉汤中生长为0.6至0.8之间的A600，然后在96韦尔板中包含1％阿拉伯糖的培养基中回覆到0.1的OD600。添加了201phi2-1裂解物的连续十倍稀释液，并在30°C下连续摇动以10分钟的间隔监测A600的生长。所有生长曲线均以重复的井（每个数据点平均四个井）进行重复进行。 　　为了进行201phi2-1感染的网格制备，如前所述25-60分钟，在琼脂糖垫上感染了宿主细菌细胞。为了使Goslar感染的网格制备，在井眼载玻片中制备了10个琼脂糖垫（1％琼脂糖，25％lb），并在〜0.35的A600中与10 µL大肠杆菌（APEC 2248）细胞一起发现，然后在37°C下孵育1.5 h。将DSMZ的十微粒裂解物添加到每个垫中。在大约30 mPi时，在室温下收集了一部分被感染的细胞，并进行浸泡。通过向每个垫中添加25 µl 25％Lb的25 µL 25％Lb，并在Eppendorf管的底部进行轻柔的刮擦收集感染的细胞，然后将其刮擦。将一部分收藏品成等分，其余部分以6,000克离心45 s，重悬于上清液的0.25倍体积，其中一部分在上清液中稀释1：1。其余的细胞在37°C下在垫子上孵育至90 mPi，此时通过轻微微观评估了它们的生产感染。从37°C取出后20-30分钟开始，样品的暴跌开始，这显着减慢了感染的进展。由于在Cryofib-et后在该样品中观察到噬菌体核，因此该样品适用于本研究中进行的分析。 　　使用前不久，在使用之前，在0.19 MBAR的R2/1 Cu 200网格（Quantifoil）上沉积了4–7 µL的细胞，在使用前不久，在0.19 MBAR中发光1分钟，并在Pelco Easiglow设备中进行20 mA。将网格安装在定制的手动坠落装置（Max Planck生物化学​​研究所）中，并从网格的背面将滤纸（WhatmanNo。1）抹在5-7 s的滤纸上，然后在50:50乙烷中冷冻，然后在50:50乙烷中冷冻：丙烷混合物（Airgas）由液体氮气冷却。 　　将网格安装到与冷冻聚焦离子束铣削兼容的改良自动架中。如前所述24，将样品加载到Aquilos 2的2级冷冻离子束/扫描电子显微镜（TFS）中，并铣削以生成薄片厚度约150–250 nm厚约150-250 nm。 　　使用Titan Krios G3透射电子显微镜（Thermo Fisher Scientific）对薄板进行成像，该电子显微镜（Thermo Fisher Scientific）以300 kV的配置，用于无条纹的照明，并配备了K2定向电子探测器（GATAN）安装的量子量子968 LS Imaging Filter（Gatan）。显微镜在EFTEM模式下以20 eV的缝隙宽度进行操作，并使用70 µm的客观孔径进行操作。使用Serialem-V3.8B1125进行自动数据采集，并在计数模式下使用K2收集所有图像。 　　对于2phi2-1感染的叶绿素的薄片，倾斜系列以3.46Å的像素大小在标称的±51°范围内，在3°步长的标称范围内，使用剂量对称方案26分组2，每剂量对称方案26，每个倾斜度为1.8 e-Å-2和总计约120 e-2 e-Å-2 em-Å-Å-Å-Å-Å-Å-Å-Å-Å-Å-Å-Å-Å-Å-Å-Å-Å-Å-2倍。沿倾斜轴的实现散热范围为-4.5至-6 µm，获得了9个倾斜序列。另外两个六个倾斜系列的数据集以4.27Å的像素尺寸收集，标称倾斜范围为±50°，±60°以2°步长以2°步长，使用剂量对称方案，每倾斜度为1.8-2.0 e-2.0 e-Å-2，总计约100-110 e-2 e-2 e tilttilt tilt tilttilt tilt tilttilt tilttilt tilttilt tilttilt tilttilt tilttircy timn tilt系列。 　　对于Goslar感染的APEC 2248的薄片，倾斜系列以4.27Å像素的大小在标称范围±56°的标称范围内以2°步长以2°步长，使用剂量对称方案，每剂量对称方案，每个剂量对称方案，每倾斜2.6 e-Å2，总计2.6 e-Å-2，总计约150 e-2 e-2 e-Å-2 tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt tilt。沿着倾斜轴的实现的散焦范围为-5至-6 µm，获得了21个倾斜系列。 　　除非另有说明27，否则使用Warp-V1.09进行所有倾斜序列预处理。倾斜电影的全框运动纠正，并使用Etomo（IMOD-V4.​​10.28）通过补丁跟踪对齐28。使用反卷积过滤器重建断层图，以可视化和3DMOD（IMOD-V4.​​10.28）中的手动拾取。随后报告的所有分辨率估计均基于使用高分辨率噪声替代的蒙版，独立精制半映射之间的傅立叶壳相关性的0.143-Cutoff标准，以减轻掩盖掩盖伪影29。 　　首先，对于以每位像素为3.46Å收集的2phi2-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1--1-1phiagrapic ost thagrogation的数据集的平均图是使用最近开发的多粒子框架，M30（扩展数据1N）来改善初始开发的倾斜序列对准。在整个断层图上手动挑选了一组400个颗粒，以每个像素为20Å，并在Relion-V3.1.1中对齐以生成初始参考31,32。该数据衍生的参考用作模板匹配对每个像素层图的20Å，采样速率为15°。在Cube（https://github.com/dtegunov/cube）中策划了模板匹配的命中，最终导致了17,169个粒子选择。将初始粒子集以每个像素为10Å提取，并进行class3d，然后选择11,148个颗粒进行进一步分析。策展粒子集的精炼3D达到了20Å的纳奎斯特限制。以每个像素为3.46Å，将精制颗粒进口到M-V1.09中。从图像射击和粒子姿势开始进行三个改进的迭代，然后结合了阶段角度和体积 - 沃普的细化，最后包括单个倾斜度对齐。该过程在估计分辨率约为11Å的情况下导致核糖体重建。相关粒子的进一步细化产生了约10Å的估计分辨率的重建。在3D分类和多粒子改进方面均未导致核糖体重建改进。 　　使用核糖体比对元数据以每个像素为20Å重建新的断层图。使用3DMOD32，在这些更新的断层图中，在这些更新的phage核的周围噬菌体的周围量表。使用自定义MATLAB（MATHWORKS，V2019A）脚本和内置Dynamo-V1.1.514函数将迹线转换为表面模型33。每4 nm沿表面模型进行一次采样，以表面垂直于表面（即朝着细胞质的正z），并从归一化的，对比度传递函数（CTF）校正的断层图中以每像素为10Å，在480Å的侧长盒中，使用Dynameo33在480Å的侧长盒中提取。使用适用于UCSF Chimera-V1.1535的位置对象插件策划了66,887个提取的颗粒的初始方向，并手动翻转了不正确的定向粒子。 　　为了生成初始参考，在Dynamo-V1.1.514中，对来自2个断层图的17,622个颗粒的子集进行了几种迭代。对于此过程，没有执行点组对称性，每种相互作用的临时低通滤波器限制为40Å，并且限制了平面外搜索以防止侧面的翻转。对齐趋于融合以产生符合明显平方（P4，442）晶格的重建。使用位置对象34和邻居图36对粒子位置和方向的分析与重建平均值一致，并指示在一致的四倍轴之间的间距约为11.5 nm。 　　随后使用初始参考来对齐整个数据集，以在发电机中的单个迭代中对齐。在此步骤中，对齐限制为40Å，限制了平面外搜索以防止侧面的翻转，C4对称性强制，并施加了240Å的圆柱形对准面膜。使用位置对象34和邻居图36对粒子位置和方向的检查再次与类似方形的布置一致。为了处理初始过度采样，将粒子重复分解为另一个粒子的9 nm中心距离内的粒子，而将较低的互相关与重建的粒子进行了较低，从而导致21,165个保留粒子。此外，进行了基于几何的清洁步骤，以在10至13 nm内清除少于三个邻居的颗粒，从而导致8,454个保留颗粒。 　　以每三通图将策划的粒子集分为大致相等的一半集，使用Dynamo2M-V0.2.2软件包将恒星文件格式转换为恒星文件格式，并以每个像素在Warp中以5Å的方式将其重新提取为480Å边长的盒子，以供您使用。使用40Å低通滤波参考，C4对称性，从3.7°开始的本地搜索和宽阔的软形掩码进行了一轮精炼3D。这导致了8,454颗粒套件的估计分辨率的重建。 　　使用320Å球形掩码和C4对称性进行了无比对的分类，以促进相对较低的粒子计数收敛。这区分了三个不同的类，对应于凹面（2,033个颗粒），平坦（4,475个颗粒）和中央四聚体的凸状（945个颗粒）状态，以及噪声类别（1,001个粒子）。与可解释类别相对应的粒子以每个像素为5Å的320Å框重新提取，并进行3D自动再填充，如共识重建所述。降低，中间和升高类的估计分辨率分别为20Å，18Å和23Å。在上述共有粒子集或上述三个类别的M中进行的细化并不能在重建方面显着改善。这可能归因于使用宿主核糖体30的倾斜序列比对（最分辨率限制因子）的先前细化。 　　预处理以4.27Å收集的2015-1Phi2-1感染的叶绿素数据集的12个倾斜系列被预处理，并如上所述平均宿主核糖体。从上方的核糖体重建低通滤波至40Å，并用于Warp-V1.09中的模板匹配，并在Cube中策划以产生47,469个粒子位置。将核糖体以每个像素为10Å提取，并在Relion-V3.1.1中进行无参考的3D分类，从而产生15,782个亚图。蒙版自动填充导致重建，估计分辨率为28Å。M中倾斜序列参数的细化将分辨率提高到约20Å（未显示）。 　　对于每个像素数据集4.27Å中的201pphi2-1核，我们无法使用邻居图确定的上述参考或从上述重建的重建来完全解析准静态寄存器。因此，该数据集仅包括在对未识别的球形体的分析中，而没有进一步的亚图平均图。 　　预处理的Goslar感染的APEC 2248倾斜系列和宿主核糖体的平均平均相似。最初的宿主核糖体参考是由400个随机选择的粒子生成的，用于Warp-V1.09中的模板匹配，并在Cube中策划以产生98,981个粒子位置。将核糖体以每个像素为10Å提取，并在Relion-V3.1.1中进行无参考的3D分类，分别区分了70s和50s类，分别包含46,056和3,710个颗粒。将颗粒以每个像素为6Å重新提取，并进行3D自动再填充，分别在50s和70s类中产生20Å和14Å。M中倾斜序列参数的细化，然后以每个像素为4.27Å的额外的3D自动再填充，分别在50年代和70年代在50s和70年代分别导致12Å和8.54Å（数据的Nyquist限制）。 　　对于Goslar核，从6个断层图中追溯了核周围，并用于提取正常的过度采样点，从而导致42,416个初始颗粒。如上所述，使用了10,512个颗粒的子集在C1中产生Ab的参考。最初的Goslar参考提出了类似的间距（〜11.5 nm）和明显的C4对称性，与201pphi2-1重建相似，但是平均值在相反的四倍轴上收敛。为了易于随后的分析，Goslar初始参考的中心移动以匹配201PPHI2-1。如上所述进行了整个数据集的比对，基于距离的清洁后对齐后有4,501个颗粒用于进一步处理。在关系给予C4对称性的关系中的对准和重建导致重建，估计分辨率为27Å。类似于共识细化的201pphi2-1，3D分类，而无需对齐将数据分为中央四聚体的类别（2,802）或凸（1,699）。这些类别的完善导致重建，估计分别为20Å和25Å的降低和升高类别的分辨率为25。 　　使用FIJI38，手动鉴定了USB，并根据其线强度曲线的最大表观直径为20Å。为了评估这些隔室的表面是否具有潜在的结构，我们尝试对隔室表面的小图分析基本上如37,39所述。我们无法获得表现出正常基础结构的重建，如视觉和邻居图所评估。然而，尽管它们的外膜不同，但USB的内部密度在视觉上与核酸像噬菌体内部的核酸一致。 　　首先使用TomoseGmemTV40粗切碎，然后对Amira-V6.7（TFS）进行手动修补，对每个像素层图进行了20Å的分割和噬菌体周长的分割。为了进行分割，使用以每个像素为20Å的粒子对噬菌体，尾部，phuz和类似RECA的颗粒进行粗略的亚图平均过程。对于衣壳，所有颗粒都是手动挑选的。通过与Relion-V3.1.131,32（尽管具有C5对称性的衣壳）强制执行二十面体对称性，从而执行了带囊的参考产生和对齐，以促进低颗粒数量的收敛。对于噬菌体尾巴，手动定义了沿细丝轴的起点和终点，并用于在Dynamo-V1.1.1.51433,41中播种过度采样的细丝模型。使用Dynamo-V1.1.514从两个具有透明极性的全长尾巴产生了尾巴的初始参考。所得参考显示了明显的C6对称性，该对称性是通过使用Dynamo-V1.1.514和Relion-V3.1.1从给定断层图中对齐的所有尾巴的实施。与噬菌体的尾巴相似，采摘并精制了phuz和reca样细丝，但没有执行对称性。我们不报告这些平均值的解决方案索赔，而是仅用于分段中的显示目的。删除重复的粒子，并使用Dynamo_table_place将最终平均值放回其各自的层图的参考框架中。为了清楚起见，选择了500个核糖体的随机子集以在分割中显示。 　　图1D中描述的噬菌体核的分割，以每个像素为2 nm，使用pycurv42估算壳的主要曲率。Pycurv以默认参数和三个像素的热门半径运行。出于可视化目的，使用以下公式将主曲率值（κ1，κ2）从曲率半径（r（nm -1））转换为角度（（nm -1）））： 　　其中r是曲率半径（κN的逆）和s是限制的多边形的侧面长度，以5.75 nm的形式。 　　噬菌体201p-1（GP105; NCBI登录YP_001956829.1）和Goslar（GP189; NCBI登录YP_009820873.1）的全长嵌合蛋白与N-P_009820873.1）与N-terminal Tev蛋白酶添加了2个tageTER 2-BERKEELEN 6 TAGEREN uc uc uc uc tageene yp_009820873.1）＃29666）。通过PCR诱变和等温组装克隆截断和其他修饰的构建体，并插入同一载体。通过将细胞生长至A600 = 0.8，在大肠杆菌Rosetta2 plyss（Novagen）中表达蛋白质，诱导0.3 mM IPTG的表达，然后在20°C下生长16-18小时。通过离心收集细胞，并将其重悬于缓冲液A（50 mM Tris pH 7.5、10 mM咪唑，300 mM NaCl，10％甘油和2 mMβ-Mercaptoeto乙醇）中，然后通过超声处理和裂解液裂解，并由离心液溶解。通过Ni2+亲和力方法纯化蛋白质。将纯化的蛋白短暂离心以沉降到浮动颗粒（可见的大型组件和聚集的蛋白质）。将蛋白透析透析为缓冲液B（20 mM Tris pH 7.5，250 mM NaCl，2 mMβ-羟基乙醇），并使用TEV蛋白酶与过夜孵育在4°C下裂解N末端组氨酸标签。通过Superose 6增加10/300 GL柱（Cytiva）在缓冲液B中进一步纯化了检索到的无标记蛋白。 　　为了通过SEC-MALS进行分析，在2 mg ml-1处的100μl蛋白质样品通过缓冲液B中的超级糖6增加了10/300 GL柱（Cytiva）。在Minidawn Treos和Optilab T-Rex T-Rex检测器（Wyatt技术）（WYATT技术）中收集了光散射和折射率（WYATT技术），并使用了MERICL量（WY ARTAR）计算了（WY ARTA）（wyAtt v。 　　为了进行网格制备，从尺寸排斥色谱法（估计浓度为4 µm的单体，0.3 mg ML-1）中收集新鲜纯化的重组201PPHI2-1嵌合蛋白。在使用之前，将R2/2 Cu 300网格（Quantifoil）在0.19 MBAR上发光1分钟，在Pelco Easiglow设备中20 mA。将样品应用于网格，作为在16°C和100％湿度的Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher Scientific）的环境室中的3.2 µL下降。在应用样品后，将网格用滤纸立即印迹3 s，然后浸入50:50乙烷：丙烷混合物通过液氮冷却。将网格安装到标准的自动架（Thermo Fisher Scientific）中进行成像。类似地制备了重组Goslar嵌合蛋白的网格，但是在爆炸之前，将样品浓缩至单体（2.5 mg ML-1）的修改是，将样品浓缩至约33 µm。用6 nm BSA-Tracer Gold（电子显微镜科学）在稀释1：1后，在洗脱浓度下，从每个纯化的空隙峰在洗脱浓度下进行了类似的冷冻。 　　使用Titan Krios G3传输电子显微镜（Thermo Fisher Scientific）对所有样品进行成像，该电子显微镜（Thermo Fisher Scientific）以300 kV的配置，用于无附带的照明，并配备了K2定向电子探测器（GATAN）安装的量子量子968 LS Imaging Filter（Gatan）。显微镜在EFTEM模式下以20 eV的缝隙宽度进行操作，并使用70 µm的客观孔径进行操作。使用Serialem-V3.8B1125进行自动数据采集，并在计数模式下使用K2收集所有图像。 　　对于201phi2-1 24mer样品，使用像素大小为1.376Å，使用剂量对称方案25从±51°以3°台阶和3个分组3的倾斜度为4.7 e-Å-2，从±51°和3个分组3中获取倾斜系列，导致164.5 E-Å-Å-Å-Å-Å-Å-Å-Å-2每倾斜系列。总共4个倾斜系列沿倾斜轴的实现的散焦为-2.5至-4 µm。水疗中心的电影以1.075Å的像素大小记录，其通量为42.6 e -Å -2在40帧上均匀分布。使用带有主动梁倾斜补偿的图像移动进行自动数据采集，每个阶段运动每个孔都会获得九部电影。总共获得了4,192部电影，实现的散焦范围为-0.1至-1.5 µm。 　　对于Goslar 24mer样本，将水疗中的电影以0.8452Å的像素大小记录，其通量为40 E -Å -2在44帧上均匀分布。再次使用带有主动梁倾斜补偿的图像移动进行自动数据采集，每个阶段运动每洞获得10部电影。总共获得了3921部电影，实现的散焦范围为-0.1至-1.5 µm。 　　对于空隙峰样品，倾斜序列的采集类似于201P-1-1 24mer样品的样品，但使用像素大小为1.752Å，倾斜范围为±60°。 　　除非另有说明27，否则使用Warp-V1.09进行所有电影预处理。校正了201PPHI2-1嵌合蛋白的倾斜度，以进行全框运动，并使用Etomo（IMOD-V4.​​10.28）28通过贴片跟踪对齐。使用3DMOD（IMOD-V4.​​10.28）43重建了断层图，用于可视化和手动拾取子图形图。总共有203个手动采摘的子图及其相应的3D CTF体积的侧面长度为288Å。将子图形图对准并最初通过无参考的细化在C1中平均，如Relion-V3.1.131,32在估计的分辨率为22Å中所实现。C1重建显示了与201PPHI2-1嵌合蛋白原始物体的立方组件一致的特征。因此，使用C1重建作为参考和执行O点组对称性的额外的精炼将估计分辨率提高到18Å。 　　对于单粒子201PPHI2-1嵌合蛋白数据，通过5×5网格估算的接触加权和初始CTF参数进行了运动校正。通过阈值剔除显微照片，估计的散热器在0.3-1.5 µm的范围内，CTF-FIT分辨率高于6Å，导致4,098个显微照片，以进行进一步处理。使用BoxNet2（Warp-v1.09）27挑选了一组140,782个粒子位置，并使用在20个手动策划的显微照片上重新训练的模型，并使用0.95的阈值进行了重新训练。使用396Å的侧长提取粒子图像。除非另有说明，否则使用RISION-V3.1.132进行所有进一步的处理。进行了一轮无参考的2D分类，并选择了为显示内部特征的平均值分配的128,798个粒子图像以进行进一步处理。在此阶段，对2D平均值的分析表明存在四倍，三倍和两倍的对称轴，与颗粒中嵌合蛋白素的立方排列一致。因此，我们使用从上面获得的亚图平均值作为最初的参考低通滤波至35Å和O点组对称性的初始参考低通滤波，从而对粒子图像进行了3D细化，这导致以4.2Å的估计分辨率进行重建。但是，重建未显示与该分辨率估计值一致的特征（例如，未分离β链）。高表观组对称性和2D类平均分布并不支持由于首选方向引起的膨胀分辨率。通过显微照片将颗粒分为半集并没有改变重建的估计分辨率，表明膨胀的估计并不是由于在半集中分裂相同或相邻的颗粒。此外，具有和不进行对称性的大量3D分类不会产生不同的类别。所以， 通过对颗粒内的亚结构进行局部重建来研究准对称的可能性。为了减轻计算负担，首先使用Relion_particle_symmetry_expand将明显的O对称性部分扩展到C4，以完全扩展到C1，然后再删除冗余图像重复（指出四倍轴的冗余视图具有相同的最后两个Euler Angles），以产生772,788个subsparticles。在执行C4点组对称性并使用柔软形状掩码的同时，部分扩展的颗粒的细化导致重建，估计分辨率为3.6Å，具有明显改善的特征。使用245Å的侧面长度进行重新集中和重新提取，然后进行改进，将估计分辨率提高到3.6Å。CTF细化44（根据粒子散焦，每个显微照片散光，横梁倾斜和三叶片）和贝叶斯抛光45分别将分辨率进一步提高到3.5Å和3.4Å。进行了一轮2D分类，而无需对齐，以去除分配给空或不良的类别的粒子，该粒子产生了一组664,363个子粒子，并且在重新运行3D细化后的估计分辨率没有变化。尽管重建通过此过程显着改善，但C4图仍然表现出畸变的密度（例如，细长的螺旋）。3D分类的尝试并未分开不同的类别。因此，将局部重建集中在C1中的单个嵌合蛋白毒素上。同样，为了减轻计算负担，在将对称性扩展到C1之前，进行了另一轮贝叶斯抛光，在其中，使用354Å的侧面长度提取亚粒子图像，并由其CTF进行过度，然后再在真实空间中裁剪至200Å侧长度。在执行C4点组对称性的另一轮3D完善之后，数据扩展到C1，导致2,657，2,657，452个子粒子，并精制成3.3Å的估计分辨率。贝叶斯抛光作业是重新运行的，以在整个方框尺寸上提取子粒子，而无需通过其CTF进行预先攻击，以进口到CryoSparc-V3.246。使用用户提供的静态面膜，边缘化和FSC噪声替代选项在C1中进行了一轮局部非均匀修补47，这导致201phi2-1 Chimallin单体的最终重建，估计分辨率为3.1Å。 　　Goslar Chimallin单粒子数据的预处理类似于201PPHI2-1 Chimallin数据，该数据在初始阈值后导致2,889个显微照片以进行进一步处理。使用201PPHI2-1嵌合蛋白训练的BoxNet2（Warp-V1.09）27模型鉴定出初始粒子位置，其阈值为0.1，导致289,387个选秀权。使用400Å的侧面长度提取颗粒，并进行2D分类和子选择的迭代回合，从而导致78,532个颗粒用于初始3D细化。Goslar Chimallin颗粒表现出与上述201PPHI2-1嵌合蛋白相同的准对称性，因此使用相同的局部重建程序进行处理。准O，准C4和C1重建的估计分辨率分别为4.0Å，2.6Å和2.4Å。Relion32中的准C4和C1重建是在使用470Å侧长的粒子图像上进行的，由其CTF进行了预制，并在真实空间中裁剪为200Å侧长。如上所述，最终的C1重建是在CryoSparc-V3.246中进行的，这导致了Goslar Chimallin单体的最终重建，估计分辨率为2.3Å，从1,407,340个亚颗粒图像。 　　所有分辨率估计均基于使用高分辨率噪声替换来减轻掩盖蒙版的伪造伪影29的傅立叶壳相关性的0.143切割标准。使用与默认参数的关系计算本地分辨率估计值。使用3DFSC48 Web服务器评估了C1重建的分辨率各向异性，该Web服务器的球形值分别为0.963和0.994，分别针对201phi2-1和Goslar Maps。 　　Void Peak倾斜序列的处理类似于201PPHI2-1 24mer倾斜序列，但使用金效率进行对准而不是Etomo28中的贴片跟踪。 　　最初的单体模型是通过DeepTracer Web Server49生成的，然后是COOT-V0.9.150中的手动构建，并在Phenix-V1.19.251中进行了真实空间的改进。为了生成四聚体模型，使用UCSF Chimera-V1.1535将单体模型扩展到C4地图中，并与适当的原始核心相连的N末端片段。为了生成24mer模型，将四聚体模型停靠到六面体图中，并将C末端段重新分配到适当的原始核心。为了确保强大的改进，使用C4或O非结晶对称性约束和基于高分辨率单体结构的参考模型约束来完善四聚体和24mer结构。针对各自的未共享图的各向同性原子位移参数进行了完善。使用Molprobity52和Emringer53验证了所有模型（SI表2）。201phi2-1 24mer，Tetramer和单体模型的Emringer得分分别为0.46、2.86和2.39。Goslar 24mer，Tetramer和单体模型的Emringer得分分别为0.92、3.10和3.59。 　　使用第V1.5254和Capture55 Web服务器对立方组件的界面分析以识别相互作用的残基并计算埋藏的表面积。 　　通过拟合共识的次要图平均值，将9个嵌合蛋白四聚体排列在平板（3×3）结构中。假设立方体组件的展开是创建平面结构，则将相互作用的C末端段三轴的相互作用的C末端段重新分配给相应的杂物的四倍对称轴。C末端结构域和C末端段之间缺少的残基是在COOT-V0.9.9中手动构建的，可确保与其他建模原子没有冲突（考虑到平面模型）50。使用Dareus-Loop Web Server56构建了杂种中缺少的环路区域（残基307-319）。该建模的链（残基45-612）用于通过施加对称性来重新创建平板结构。最终，在这个平面模型中，对外围原始人的突出的C末端段进行了修剪，并在最终模型（48个链）中包括了周围中的十二个相互作用的段。 　　使用AMBER99力field58使用APBS-V3.0.057生成静电表面表示，使用PROPKA-V3.4.059通过PDB2PQR-V3.4.060,61分配质子化状态，用于分配质子化状态。 　　弹性网络模型61,62,63是正常模式分析的子集64,65。在这里，我们使用了各向异性网络模型（ANM）66和高斯网络模型（GNM）67,68,69。这两种模型都将蛋白质结构简化为一系列节点，并具有介绍性势能函数控制节点运动。为了另一种方式，每种模式都是特征向量，其相应的特征值是模型中该运动的频率。较低的频率对应于最能描述结构内在运动的动力学。Prody（1.0版）是一个软件程序，可以计算ANM和GNM模式70,71，我们在本研究中使用了。我们为ANM和GNM计算创建了20,412个节点，这是Prody中使用过的最多的节点。 　　五个最低频率GNM模式占整体差异的76％。考虑到我们不需要使用所有ENM模式来捕获系统的Dynamics72，我们选择了这五个GNM模式以及在模型中使用的五个最低频率ANM模式。GNM的Kirchoff矩阵是建立的，成对相互作用的截止距离为10Å，弹簧常数为1.0，而ANM的Hessian Matrix使用的成对相互作用截止距离为15Å，弹簧常数为1.0。ANM结构合奏电影使用了R.M.S.D.与原始构象相差25Å，以显示蛋白质片的柔韧性。 　　使用九个四聚体嵌合蛋白板模型进行仿真。该结构被质子化，并通过琥珀色的TLEAP模块将其放置在水箱中73。使用12-6离子Model74,75用Na+中和该系统。CUDA版本10.1实施76,77,78琥珀20使用了73。使用的水模型为OPC79，带有Amber 19FFSB力场80。所得系统，包括蛋白质和水箱，包含1,729,704个原子。使用最陡峭的下降和偶联梯度方法76进行总共10,000个循环的能量最小化，而重原子的力常数为10.0 kcal mol -1Å -2。接下来，使用NVT恒温器稳定在4 ns上，然后使用langevin恒温器稳定下来，将系统从10.0 k慢慢加热到300.0 k，然后稳定下来，稳定下6 ns，摩擦系数（碰撞频率）为γ= 5.0 ps -1，重原子限制为1.0 kcal mol -lol-1Å2。使用2 fs和摇动算法的时间段在NPT集合中进行20 ns进行平衡，并约束涉及Hydrogens81的键。平衡温度设置为300.0 k，其langevin恒温器的摩擦系数为82,83（碰撞频率）为γ= 1.0 ps -1，并将压力设置为1 bar，带有berendsen barostat84，放松时间常数= 1.0 ps -1 = 1.0 ps -1，强度原子强度约束为0.1 kcal mol -1 kcal mol -1 kcal摩尔 - 2。在8Å处使用范德华相互作用的截止截止量，将远程相互作用用粒子网埃瓦尔德算法85处理。平衡后，将系统克隆成五个重复的生产运行，但在NPT集合中仍设置为300.0 K。每个运行300 ns，导致总抽样的1.5 µs。 　　通过CPPTRAJ-V.25.686和MDTRAJ-V1.9.487分析了所得的分子动力学轨迹。特别是R.M.S.D.用MDTRAJ计算。这是通过计算R.M.S.D.来完成的。从每个轨迹和平均结果平均的所有四聚体的c c c c c c c totos of countomer以及中央四聚体（补充图3）。 　　使用Chap-V0.9.188进行孔隙注释进行所有其他分析。在所有模拟重复的生理上相同的毛孔之间，将自由能和溶剂密度图平均。左上象限的四个孔（四倍）孔包含两个框架，导致Chap崩溃。在与Chap开发人员协商后，将这些帧在平均之前删除。考虑到我们仍然平均为1,502帧×4孔 - 2个不良框架= 6,006帧的四个毛孔，我们认为这种去除不会在我们的结论中造成任何差异。 　　可视化了密度图，坐标模型和模拟轨迹，并用Pymol-V2.5（Schrödinger2021），UCSF Chimera-V1.1535，Chimerax-V1.2.589和VMD-1.9.4A3590生成数字。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。