过氧化物酶体泛素连接酶复合物形成逆转录通道

　　所有构造均使用Gibson组装克隆。为了过表达P. p. p. p. p. p. p. complese，对嗜热链球菌，酿酒酵母或嗜热链球菌成分编码的DNA序列被合成，并通过生命技术的基因心进行了优化的密码子。PEX12包含N末端SBP标签，然后是HRV3C蛋白酶裂解位点，PEX10包含C末端血凝素（HA）标签，PEX2包含C末端标记标签。所有基因均在载体pplcza-link的ECORI和NOTI位点之间克隆，该基因从PPLCZA进行了修饰，以允许多个基因的表达36。为了在大肠杆菌中表达环手指，将酿酒酵母基因的DNA序列合成并克隆在载体PGEX6P-1的BAMHI和NOTI位点之间，该位点含有N端谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签，然后是HRV3C蛋白酶蛋白酶蛋白酶底部。使用Quikchange（Agilent）生成所有构建体的变体。 　　S. cerevisiae野生型菌株UTL7A（MATA，URA3-52，TRP1，LEU2-3/112）由R. Erdmann（Ruhr-University Bochum）提供。使用标准转化技术以及PFA6A-NATMX或KANMX质粒构建所有单敲门菌株。使用PFA6A-HYGMX载体的同源重组，在其内源性基因座上引入了PEX2，PEX10和PEX12的FLAG标记版本。对于PEX5过表达，HA标签紧随其后的标签，将其标签融合到全长PEX5的C端子上。该基因在ATG起始密码子上游包含大约500 bp，因此PEX5是从其内源性启动子中表达的。将序列插入CEN质粒PRS416的多克隆位点（参考文献32）。用LIAC-PEG方法37进行酿酒酵母细胞的所有转化。 　　P. p. pastoris野生型菌株SMD1168是从生命技术中获得的。按照制造商的说明，通过电穿孔进行转换。在含Zeocin的YPD（YPD培养基加山梨糖醇）板上在30°C的含Zeocin的YPDS上生长3天。采摘一个菌落以接种起始培养物，该培养在30°C过夜。然后通过将启动培养物1：100稀释到缓冲最小甘油（BMG）培养基中，将大型培养物接种。将培养物在30°C下孵育约24小时，并通过切换到相同体积的缓冲最小甲醇（BMM）培养基来诱导蛋白质表达。在28°C下再孵育约20小时后，通过以4,500克离心10分钟收集细胞。将颗粒存储在-80°C下，直到进一步使用。 　　Cell pellets of about 100 g were resuspended in 100–120 ml buffer A (25 mM HEPES pH 7.4, and 400 mM NaCl) supplemented with 2 mM phenylmethane sulfonyl fluoride (PMSF) and 2 μM pepstatin A. The cells were lysed in a BioSpec Beadbeater for 40 min with 20 s/60 s on/off cycles in a water-ice bath.将匀浆以10,000g离心20分钟以去除细胞碎片。将上清液以44,000 R.P.M.的Ti45转子（Beckman）进行离心。在4°C下1小时。将颗粒的膜用缓冲液中的Dounce均匀剂重悬于，并通过离心再次颗粒。将膜重悬于200–250 mL的缓冲液中，其中含有1％Laurylmaltose Neopentylglycol（LMNG）和蛋白酶抑制剂鸡尾酒，并在4°C下孵育60分钟。通过在44,000 r.p.m的Beckman Ti45转子中离心去除不溶性材料。30分钟。将上清液转移到新的管中，并与2 mL高容量链霉亲和素树脂（Thermo Scientific）孵育1小时。将树脂用20–30 mL缓冲液洗涤，其中含有0.1％digitonin（EMD Millipore），并用10–15 mL的缓冲液B（25 mM HEPES pH 7.4，150 mM NaCl，10％甘油，10％甘油和0.1％Digitonin）补充了2 mmMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMA（SIGMA））。该复合物用100 kDa截止氨基滤器（Sigma-millipore）浓缩，并通过尺寸 - 排斥色谱法进一步纯化超级糖6 3.2/300增加柱（GE Healthcare）（GE Healthcare），用缓冲液C（25 mm HEPES pH 7.4，150 mm NACL和0.05 mm NACL和0.05％digitonin平衡）。 　　对于纳米盘的重建，首先准备了脂质库存。该库存含有10毫米的1,2-二甲酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC），1,2-二甲基酰基-SN-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）和1,2-二甲基酰基-SN-SN-SN-SN-SN-GLYCERO-3-甘油-3-磷酸 - 磷酸（Dops），并在RED中做好了准备。38。使用1：240：5蛋白质的摩尔比将纯化的蛋白质纯化为纳米盘：脂质：膜 - 脂肪蛋白蛋白1D1（MSP1D1）。将这种混合物在4°C下温和搅拌2小时孵育2小时。然后，在连续旋转的情况下在4°C下在4°C下添加生物珠（Bio-Rad）。除去生物珠，并以12,000克离心20分钟以去除聚集的蛋白质。将上清液加载到超糖6 3.2/300增加凝胶滤光缓冲液（25 mm HEPES pH 7.4和150 mm NaCl）中的尺寸排斥柱（GE Healthcare）。汇总含有纳米盘重构的连接酶复合物并浓缩到约10μm的馏分。该材料用于生成晶圆厂。 　　为了组装Fab-线酶配合物，将纯化的连接酶复合物与Fab在冰上以1：1.5摩尔比在冰上孵育1小时。将FAB-​​线酶配合物浓缩并加载在缓冲液C（25 mM HEPES pH 7.4、150 mm NaCl和0.05％digitonin）中的超级糖6 3.2/300增加尺寸排斥柱（GE Healthcare）。汇总峰分数并浓缩到约7 mg ML – 1进行冷冻EM分析。 　　为了纯化GST标记的环指结构域，蛋白质在大肠杆菌菌株BL21（DE3）中表达。首先将细胞裂解物在4°C下以10,000克离心30分钟，并将过滤后的上清液应用于谷胱甘肽树脂（GE Healthcare）。After elution with reduced glutathione, proteins were concentrated and loaded onto a Superdex 200 3.2/300 Increase size-exclusion column (GE Healthcare) equilibrated in gel-filtration buffer (25 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) and 5% glycerol).汇总峰值分数并在-80°C下存储直至使用。 　　为了纯化用于结晶的PEX12环形域，将与谷胱甘肽树脂结合的GST-3C-PEX12 RF在4°C下与预防蛋白酶一起孵育过夜，以切除GST标签。收集流通量的分数并加载到单Q离子交换柱（GE Healthcare）上。将蛋白质用盐梯度（0-500 mM NaCl和25 mM HEPES pH 7.4）洗脱，并合并峰值级分。将与PEX12环手指域相对应的分数浓缩并应用于HiloAD 16/60 SuperDex 75凝胶滤光柱（GE Healthcare）（GE Healthcare），预先校准了凝胶滤液缓冲液（25 mm HEPES，25 mm HEPES，pH 7.4，150 mm nacl，1 mm Nacl，1 mm tcep and tcep and 5％glycerol）。将纯化的蛋白浓缩至6 mg ML – 1，在液氮中闪烁液体，并储存在-80°C下。 　　PEX12环手指结构域通过将0.2μl的蛋白质与含有0.1 M Bis-BIS丙烷，pH 8.5，0.2 m sodium氟化物和20％PEGG33330的0.1 M lisevoir溶液与0.2μl的100μL储量溶液与0.2μl的100μl储量溶液混合在一起，通过悬挂式蒸气扩散方法结晶。通过添加补充30％甘油的井溶液，通过逐渐增加甘油中甘油浓度逐渐增加甘油浓度来保护晶体。将晶体从液滴中取出，并通过补充30％甘油的另一批井溶液擦拭，然后在液氮中闪烁。在高级光子源（APS）处的24-ID-C光束线以100 K收集数据。将数据索引，集成并与HKL2000/3000软件包缩放至1.5Å分辨率。 　　如上所述，将纯化的嗜热链球菌连接酶复合物重构为纳米盘，除了使用化学生物素化的MSP1D1。生物素化的效率通过用链霉亲和素涂层的顺磁珠（Promega）捕获纳米散发。为了选择Fab，使用了先前描述的Fab Phage库39。将包含连接酶复合物和文库的纳米散发稀释为选择缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl和1％BSA）。如前所述40,41进行了五轮分类。在第一轮比赛中，使用400 nm的重构连接酶配合物手动进行生物束。为了增加选择压力的严格性，通过逐步减少目标浓度进行半自动进行了四轮分选：在第二轮中200 nm，第三轮100 nm，第四轮50 nm和第五轮25 nm。使用先前描述的协议39进行了所有回合噬菌体显示。对于除第一轮以外的每个回合，每个前一轮的放大噬菌体种群用作输入池。在空的MSP1D1纳米盘中，在整个选择中使用了2μM作为竞争者。 　　进行单点噬菌体ELISA以验证从第四轮和第五轮噬菌体显示器获得的独特粘合剂。在芝加哥大学综合癌症中心DNA测序设施中进行了具有吞噬作用的单个菌落的测序，并选择了独特的克隆，并在ELISA之前放大了噬菌体，如前所述40,41。使用先前描述的协议42进行ELISA。 　　在芝加哥大学综合癌症中心DNA测序设施中对基于噬菌体ELISA结果的特定粘合剂进行了测序，然后使用融合的克隆套件（takara）将独特的克隆sublone subclone sublone callone clone suquencing设施。通过DNA测序验证了成功的克隆。然后如前所述35表达和纯化晶圆厂。纯化后，将FAB样品用4–20％SDS -PAGE验证，然后在25 mM HEPES pH 7.4和150 mM NaCl中透析过夜。使用连接酶复合物在生物素化的纳米散发中，通过多点ELISA42估算纯化的FAB亲和力。 　　以0.02 mg ML – 1的浓度在纳米盘或digitonin中重构的连接酶复合物被应用于发光的连续碳网格（电子显微镜科学，Inc.）。吸附1分钟后，用滤纸将网格抹黑以去除多余的样品，立即用4μl1.5％的1.5％新鲜制成的铀酰甲酸溶液洗涤两次，并用4μL的1.5％铀酰甲酸甲酸酯溶液孵育，以增加30 s。然后将网格用滤纸进一步印迹，以去除铀酰甲酸溶液，在室温下干燥，并用Tecnai T12电子显微镜（Thermo Fisher Scientific）对配备了LAB6细丝的Tecnai T12电子显微镜（Thermo Fisher Scientific）进行检查，并在2.113的pecixel大小上使用×52,000的名称放大倍率，以120 kV的加速电压运行。 　　将浓缩样品与MS（PEG）12甲基 - 佩格NHS-Ester（Thermo Fisher）以1:40的摩尔比在冰上孵育2小时，以减少网格上颗粒的首选方向。然后，将3.0 µL的二乙二醇化样品应用于发光的量化量子缝隙（1.2/1.3，400均值）。使用Vitrobot Mark IV仪器（Thermo Fisher Scientific）将网格用湿度约为100％的湿度，在液态乙烷中的斑点为100％，并在液体乙烷中陷入困境。 　　在HHMI Janelia Farm Cryo-Em设施上，在300 kV下运行的泰坦krios电子显微镜（FEI）收集了冷冻EM数据。使用20 eV的能量滤波器狭缝宽度宽度用于去除无弹性的电子。使用Serialem以超分辨率计数模式记录所有冷冻EM电影。×81,000的名义放大倍数对应于超分辨率模式下校准的物理像素大小为1.06Å和0.53Å。剂量速率为5.28电子Å2s -1。总暴露时间为10 s，导致总剂量为52.8电子Å2分数分为50帧（每帧200毫秒）。样品的散焦范围在-1.0至-2.5 µm之间。 　　使用Program MotionCor2（参考文献44），总共进行了9,019次剂量分级的超分辨率电影，并具有2倍嵌套，产生的像素大小为1.06Å。按照剂量加权方案计算每个图像堆栈的所有帧的总和（总计50个），并用于除DefoCus确定以外的所有图像处理步骤。该程序CTFFIND4（参考文献45）用于估计所有电影帧的汇总图像的散焦值。粒子在Relion 3.1（参考46）中进行自动攻击。在手动检查和分类以丢弃差的图像后，分类进行了3.1中的分类。总共提取了总共3,224,513个颗粒，并进行一轮无参考的2D分类，以去除错误的选择和明显的垃圾类别。为了加快数据处理过程中的3D分类，整个数据集按其集合的顺序分为四批，每个批次分别进行3D分类。每批只有一类显示该类别的蛋白质特征和颗粒，以进一步分类（总共1,007,363个颗粒）。使用先前3D分类作为初始模型的重建和蛋白质和洗涤剂胶束周围的软膜进行重建，在此粒子集上进行自动再填充。在这一轮精炼之后，颗粒进行了贝叶斯抛光，然后使用包含连接酶配合物和Fab的掩模进行了另一轮自动再填充和聚焦精致。在此步骤中的细化产生了3.3Å的地图。使用聚焦精致后获得的角度分配，使用自适应掩模进行1.8°局部3D分类（2 Sigma和T = 20），以进一步对粒子进行分类。从一个类别中选择了总共795,444个颗粒，并进行了另一轮自动填充。3D分类（T30）无需对准，但使用掩模，用于进一步提高地图的质量。选择121后644个颗粒，最后一轮自动再填充，然后使用自适应遮罩进行聚焦精致，在3.1Å处产生了地图。用RESMAP v1.1.5（参考文献47）计算局部决议，并在Relion 3.1中进行了MAP锐化。所有报告的决议均基于金色标准的改进程序，傅立叶相关性= 0.143标准。使用3DFSC Server48计算了定向傅立叶相关曲线和球形值的直方图。所有软件均由SBGRID49支持。 　　所有模型均在COOT50中建造，并使用3.1Å锐化的密度图在Phenix51中进行了完善。对于PEX2，PEX10和PEX12，可以轻松鉴定每种蛋白质的跨膜螺旋，并最初被构建为poly-ala。然后，我们使用二级结构预测和笨重的残基（例如phe，trp和arg）作为符号柱，将跨膜螺旋手动拟合到密度，并追踪跨膜段的骨架以及它们之间的接头。密度图具有足够的质量，可以为关键残留物分配旋转器。在无法分配旋转器的情况下，侧链是在Cβ原子上固定的。使用Phenix Real_space_refine在没有二级结构约束的情况下在真实空间中进行了完善。phenix real_space_refine中强的非结晶对称约束用于固定未完善的域。在视觉检查后，进行了几次使用Phenix和Coot进行手动完善和全局精炼的迭代。对于环手指域，使用Raptorx52或Alphafold 2（参考文献53）生成每个环域的同源模型。然后，将这些模型拟合到UCSF Chimera54中的密度图中，并使用Xtalpred Server的二级结构预测作为附加指南转移到COOT进行手动模型构建。对于Fab型号构建，将沉积的GGMFSD2A Fab Complex（PDB ID：7MJ）的Fab部分用作起始模板，并用嵌合体手动将其扩展到冷冻EM密度中。该模型是通过自动改进的迭代回合来完善的。由于其密度弱，将FAB常数结构域的结构除去。对于脂质的模型，将麦角固醇或POPC的PDB文件导入了COOT并将其作为配体的密度拟合。 　　PEX12 RF晶体数据集以0.967Å的波长收集，Zn2+具有强烈的异常信号。该信号给出了优质的异常数据，使Shelxd可以直接定位锌原子。使用此数据集和较重的原子位点使用Sharp Program55计算相位概率分布。衍生相的质量使大多数PEX12 RF模型自动或在COOT中手动完成。使用REFMAC56进行了细化。 　　使用UCSF Chimera54，Chimerax57和Pymol（Pymol Molecular Graphics System，2.0版，Schrödinger，LLC。）进行原子模型的可视化。 　　在Leu2基因座的酿酒酵母细胞中，紫cio（Vioa，Viob和Vioe-Skl）19分为紫菜。简而言之，用Noti-HF消化了质粒PWCD1401或PWCD1402（参考文献58），并使用凝胶提取的11.5-kb片段进行转化。在SD-LEU板上选择克隆。如上所述，使用含有紫ack的途径的菌株用于生成PEX2，PEX10和PEX12的敲除。 　　为了补充缺乏PEX2，PEX10或PEX12的菌株，野生型蛋白或突变体的标记标记版本是从每个基因的内源基因座表达的。如上所述，使用Vector PFA6A-HYGMX通过同源重组引入基因。将质粒转化为含有紫紫色途径但缺乏PEX基因的细胞，并在SD-LEU培养基上选择。每种转化的三个菌落都在SD-LEU板上条纹，每个转化的一个菌落在30°C的YPD培养基中被选中，以在250 r.p.m的震动下在YPD培养基中进行过夜生长。然后将饱和培养物稀释到3毫升新鲜SD-LEU培养基中，并生长约60小时。 　　提取绿色颜料PDV如下。将细胞沉淀重悬于300μl冰川酸中，并转移到薄壁的Eppendorf管中。然后将管子在95°C孵育15分钟，通过反转混合并再孵育15分钟。首先在4,700 r.p.m处通过离心5分钟去除细胞碎片。然后通过用AcropRep Advance 0.2-μm过滤板（PALL Corporation）过滤上清液。将滤液转移到96孔的非透明板（Greiner Bio-One）中。使用欣赏和发射波长分别为535 nm和585 nm，用微板读取器（Bio-Tek Synergy NEO2）确定荧光。 　　在30°C下，在反应缓冲液（25 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl，10 mM MGCL2和50μMTCEP）中进行体外多泛素化测定。蛋白质成分的浓度为：0.1μMUBA1、4μMUBC4、0.5μMGST -RFS和100μM泛素。该混合物还含有1μMDylight-Maleimide-800标记的CYS-泛素。通过添加5 mM ATP开始反应，并在60分钟后通过添加4×SDS样品缓冲液终止。通过4-20％SDS-PAGE和荧光在800 nm的荧光扫描（LI-COR）分析样品。 　　如前所述59，通过液相色谱 - 随量质谱法制备样品并通过液相色谱 - 潮汐质谱法分析。简而言之，将酵母细胞培养在50 mL YNBG培养基（0.3％酵母提取物，0.5％肽，0.67％的酵母氮含有氨基酸和0.5％葡萄糖，pH 6.0）中过夜，直到对数阶段，然后切换到Ynbo培养基中，然后切换到Ynbo培养基中tween40和0.1％油酸，pH 6.0）再诱导过氧化物酶体增殖。将细胞颗粒重悬于裂解缓冲液（8 m尿素，200 mM EPP pH 8.5和蛋白酶抑制剂（Pierce））中，然后使用Biospec珠珠蛋白酶抑制剂（Pierce）进行五个周期，在30 s上，随后每周周期60 s休假。将匀浆以2,000克离心10分钟以去除细胞碎片，并将上清液转移到新管中。用5 mM TCEP还原样品30分钟，用10 mM碘乙酰胺烷基化30分钟，然后用10 mM DTT淬灭15分钟。精简的串联质量标签标签和液相色谱 - 质谱均按照参考文献中所述的协议进行。59。基于定量的同质标签蛋白质组学数据处理是使用MSConvert 3.0（https://proteowizard.sourceforge.io/tools/msconvert.html）和2021.02 Rev进行的。0（http://comet-ms.sourceforge.net/）。 　　缺乏PEX2和PEX12以及表达来自内源性启动子下天然基因座的野生型PEX2和PEX12野生型PEX2和PEX12野生型PEX1和PEX12的酵母细胞在50 mL YNBG培养基中培养，直到一夜之间直到对数阶段。将细胞再转移到YNBO培养基中18小时，以诱导过氧化物酶体增殖。如上所述，使用玻璃珠裂解细胞，并通过离心去除细胞碎屑。通过45,000 R.P.M.60分钟。将膜匀浆并溶解在含有1％Triton X-100的裂解缓冲液中1小时。然后将提取物与10μL抗FLAG M2树脂在4°C下孵育2小时。用含有0.1％Triton X-100的裂解缓冲液洗涤珠3次，并用含有0.4 mg ml – 1的3×FLAG肽（Sigma）的缓冲液洗脱结合的蛋白质。洗脱的蛋白质接受SDS -PAGE和免疫印迹。使用抗FLAG（F7425，Sigma）抗体在1：3,000稀释度中检测到FLAG标记的PEX2和PEX12。作为负载对照，用抗SEC61α抗体（自制兔子血清）以1：3,000稀释的溶液对总细胞裂解物进行免疫印迹。 　　所有生化实验均独立进行至少三次，结果相似。与在PEX2，PEX2，PEX10，PEX12或PEX5的突变体中相比，使用GraphPad Prism 9.3.0对多个比较进行多个比较的单向方差分析。图1所示的条形图。3D和4C – G和扩展数据图2。5H和8C，D显示了单个数据点，平均值和S.E.M.来自三个生物重复。NS，不重要；*p <0.1，** p <0.05，**** p <0.001。基于定量的同类标签蛋白质组学实验是独立两次进行的，结果相似。结果（扩展数据9）的统计数据是通过多个未配对的t检验进行的，然后是两阶段升级的方法（Benjamini，Krieger和Yekutieli），基于三个生物学重复，需要进行虚假发现率（q）= 1％）。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。