B细胞策划对神经霉素炎的耐受性Optica自身抗原AQP4

　　C57BL/6J，Aireflox/Flox，Rag1 - / - ，CD40 - / - 和TCRA - / - 小鼠是从Jackson Laboratories获得的，并在我们的设施中繁殖。AQP4 - / - 小鼠由A. Verkman44提供，O。P. Ottersen提供了AQP4Flox/Flox Mice45，L。Klein提供了FoxN1-Cre Mice46，MB1-CRE小鼠提供了M. Schmidt-Suppprian和Dereg Mice 48提供的MB1-CRE小鼠47，由M. Schmidt-suppprian和Dereg Mice 48提供。为了生成小鼠的小鼠特异性切除loxp的盒式盒，用指定的CRE小鼠繁殖了小鼠。所有小鼠菌株均在C57BL/6J背景上。小鼠被安置在慕尼黑技术大学的无病原体设施中。所有实验方案均由常务委员会批准与巴伐利亚州当局的实验动物进行实验，并按照相应的指南（ROB-55.2-2532.VET_02-17-234，ROB-55.2-2532.VET_02-20-20-20-20-20-01，ROB-55.2-2532.VET_VET_02-202-20-33，ROB-55.2-2532.VET_02-17-234，ROB-55.2-2532.VET_02-21-154）。 　　对于骨髓嵌合体的产生，受体小鼠被致命照射。总剂量为9个灰色（GY），分别为两个4.5 Gy剂量相距3小时。当Rag1 - / - 小鼠用作骨髓受体时，仅用4.5 Gy辐射一次。辐照后1天，将总共5×106的骨髓细胞注射到受体中。为了产生混合骨髓嵌合体，从两只不同的供体小鼠的骨髓汇总并按照指定注射。在细胞转移后2周，将重建的小鼠维持在抗生素水（Enrofloxin，Bayer，0.1 mg ML -1）上2周。造血系统的重构在外周血中进行了测试。 　　小鼠MOG（35–55）（Mevgwyrspfsrvvhlyrngk）和小鼠AQP4（201-220）（Hlfainytgasmnparsfgp）分别通过Auspep或Biotrend合成。人mog蛋白是从生物体现获得的，使用杆状病毒诱导细胞表达系统产生小鼠AQP4蛋白，并如前所述纯化6。 　　用200μl含有200μgmog（35-55），200 µg的AQP4（201-220），100 µg全长AQP4或100 µg全长的人MOG溶解在PBS中的PBS，并将250 µg溶解的小鼠，将小鼠在尾部的底部免疫皮下免疫。（BD DIFCO）在矿物油中（CFA）。此外，小鼠接受了200 ng百日咳毒素（Sigma-Aldrich，p7208）i.v.免疫后第0天和第2天。每天以如下分数监测疾病的临床体征：0，无疾病；1，失去尾声；2，矫正障碍；3，两个后肢的瘫痪；4，四脑；5，垂死状态49。 　　通过100μM细胞滤网（Greiner Bio-One）通过淋巴结，脾和百里香，然后通过重力离心（400G，4°C，10分钟）。脾样品使用BD Pharm Lyse（BD Biosciences）进行了红细胞裂解。 　　将淋巴组织的单细胞悬浮液与磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的活/死固定染料（Aqua; 405 nm激发）一起孵育15分钟。用FACS缓冲液（PBS中的2％FCS）洗涤细胞，并在冰上与对表面标记的抗体孵育30分钟。对于细胞内染色，将细胞进一步固定并透化（Cytofix/Cytoperm和Perm/Wash Buffer； BD Biosciences），并用抗细胞内标记物染色过夜。补充表2中提供了所有使用的抗体的列表。 　　使用Cytexpert（v.2.3.1.22）软件或FACSARIA III（BD BIOSCIENCES）系统对细胞流式流式细胞仪（Beckman Coulter）进行了流式细胞仪分析，并使用BD FACSDIVA（v.8.0.1）软件和流式网络图数据分析了Flow.1.1.1.1.10.1.1.10.1.10.110.110.110.110.110.110.110.110.110.110.110.110.110.110.110.110.110.110.110.110.110.110.110.1。 　　对于I-AB – AQP4（205–215）和I-AB – PLP（9–20）的四聚体染色，如先前所述50,51。将细胞用0.7 U mL-1的神经氨酸酶（Sigma-Aldrich，N-2133）和10 nm的达沙替尼（SelleckChem）在37°C下30分钟30分钟，持续30分钟，持续5％CO2，洗涤两次，用FC块处理15分钟，并在冰上进行15分钟，并随后在室内固定，并在室内固定，并在室内固定2 H，并在I-Ab Tetramers中置于2H中，并均经过2 H的温度。细胞内染色以进行流式细胞仪分析。还使用抗PE和抗APC磁性细胞分选（MAC，MILTENYI BIOTEC）磁性磁珠，根据制造商的说明，在流动细胞仪分析之前，还使用抗PE和抗APC磁性细胞分选（MAC，MILTENYI BIOTEC）磁珠富集流动性磁珠。 　　如先前所述，分离了TEC 52。通过对PBS的心内灌注在深度麻醉下实施安乐死后，彻底解剖了胸腺，以避免血液污染并立即去除粘附的淋巴结。将解剖的百里香放入含有RPMI，0.05％Liberase TH（Sigma-Aldrich）和100 U ML-1 DNase I（Sigma-Aldrich）的酶溶液中的六孔板中，并通过轻轻移液器将其与重复的机械解散孵育，并在37°C下孵育。大约60分钟后，将上清液合并，洗涤并通过100 µm滤波器。根据制造商的说明，胸腺细胞用CD90.2 Mac珠耗尽。最后，在活的CD45 – EPAM+，在CD45+EPCAM – CD19+的Live CD45 – EPAM+上分类TEC，并在CD45+EPCAM – CD19 – CD19 – CD11C+MHC-IIHIGH上以2％的BSA为PBS上的CD45+EPCAM – CD19 – CD11C+MHC-IIHIGH上的胸腺DC。 　　如先前所述53分离出一级星形胶质细胞。剖析了新生儿C57BL/6J小鼠1至3天的大脑，并从脑膜中清除并清除脑膜，用DNase I（1 mg ML-1）和0.25％胰蛋白酶 - 乙二醇甲苯甲甲乙酸乙酸（EDTA，CALBIOCHEM）消化15分钟，并通过细胞菌株（70°MM）。将单细胞悬浮液在37°C的175 cm2细胞培养瓶中培养，并涂有2 µg mL-1聚赖氨酸（Sigma-Aldrich）。7-10天后，混合的胶质细胞培养到汇合，并通过在180 rpm的依次摇动30分钟和220 rpm消除小胶质细胞，持续2小时，在摇动步骤之间和之后改变介质。 　　使用RNAeasy迷你试剂盒（Qiagen）从分类的细胞中分离总RNA。根据制造商的说明，使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific）将分离的RNA转录为cDNA。从Life Technologies购买了探针，并使用384孔反应板（Life Technologies）的Taqman Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher Scientific）进行测定。定量PCR（QPCR）在Quant Studio 5系统（Life Technologies）上进行。在所有实验中，使用GAPDH（MM99999915_G1和HS00230829_M1，Thermo Fisher Scientific）用作校准基因表达的参考基因。 　　在深度麻醉下，通过心脏内灌注对小鼠进行安乐死，然后用溶解在PBS中的4％（w/v）多聚甲醛（PFA）灌注。将所有器官拆除并固定在4％PFA中过夜。在石蜡嵌入之前，椎骨（包括脊髓）在包括脊髓（包括脊髓）的72 h中还脱位了72小时。制备了2μm厚的切片。使用Leica Bond RXM系统与聚合物精炼检测试剂盒（Leica）进行免疫组织化学。补充表2中提供了所有使用的抗体的列表。用作发色原，并用血久毒素进行了抗染色。然后在Leica AT2系统上扫描幻灯片，并使用Qupath V.0.3.2（https://qupath.github.io，苏格兰爱丁堡大学）分析图像。 　　用QuPath提供的计算机辅助算法自动执行组织学样本的量化。为了检测总细胞计数，对目标区域进行注释并通过阳性核检测自动分析。所有注释均以盲目的方式进行。 　　人类新生儿胸腺组织获自A.Büttner（由当地伦理委员会的批准，A2023-0038）。使用EDTA缓冲液和蒸汽烹饪进行抗原检索，然后使用标准方案进行免疫荧光。补充表2中提供了所有使用的抗体的列表。 　　脱蜡后，使用福尔马林固定的，石蜡填充的（FFPE）组织的4μM串行切片对抗CD20抗体（DAKO）进行免疫组织化学，根据标准方案。用50％吉尔的血久毒素1（American Mastertech）进行反染色，用自来水和0.02％的氢氧化铵融合。载玻片用二甲苯和生态原（Ecomount，生物保健医疗）安装。 　　为了测试CD20和AQP4的共定位，脱蜡剂和阻塞后两个标记的人性胸切片均依次构成。使用HC PL APO CS2×40/1.30 NA物镜，在倒置的TCS SP8共聚焦显微镜（Leica）上分析了染色的切片。将共聚焦图像作为具有1 µm z间距的瓷砖图像堆栈采集，并使用Imaris v.9.7（牛津仪器）分析了3D图像量。 　　除了进行流式细胞仪分析的表面染色外，还将来自不同免疫区室（脾，淋巴结，骨髓，胸骨，血液）的单细胞悬浮液与TotalSeq-C-C抗小鼠主题标签1-3和5-6和5-6（M1/42; 39-F11，BioleGend，1：100 for Allustrer for Allustrer for Aldruter for Aldrutrer for Aldrurers for Allurers constrentions 1-3和5-6（M1/42; 39-F11，1：100）。转储通道由CD3，CD11b，F4/80和NK1.1定义。从每个隔室中，将12.000个活的DUMP-CD19+细胞分别分为FCS涂层的96孔板。 　　如前所述54，使用10倍铬单细胞5'溶液（Chromium snext Gem单细胞VDJ v1.1）制备SCRNA-SEQ，SCBCR-SEQ和细胞散列文库，具有针对细胞表面蛋白的特征条形码技术，10x基因组学）如前所述。简而言之，分类的细胞被转移到铬下一个宝石芯片（10倍基因组学）中，并通过铬控制器（10x基因组学）自动进行分配。图书馆的准备是根据制造商的说明进行的。为了进行质量控制和定量，使用了生物分析仪2100（安捷伦技术）。最后，图书馆在Novogene提供的Illumina Novaseq 6000系统上进行了测序。 　　Novogene提供的SCRNA-SEQ读取使用Cell Ranger（v.7.1.0）55计数管道与选项“ Include Introns”禁用。根据已建立的指南57，使用Scanpy（V.1.9.2）56进行预处理，聚类，注释和可视化。57。具体而言，对于质量控制，排除了超过15％线粒体基因计数的细胞，以及具有超过2％血红蛋白基因计数和小于5％核糖体基因计数的细胞的细胞。还去除了每个细胞中检测到的基因和细胞少于200个基因和细胞的细胞。使用scrublet（v.0.2.3）58进行双重排除。总体而言，质量控制消除了1,926个细胞。在少于三个细胞中总共检测到的16,783个基因被排除在外。为了关注B细胞特异性以外的子集变异性，排除了数据集中检测到的254个变量B细胞受体链基因。将基因计数标准化为每个细胞总数1×104，并且通过LOG1P转化稳定方差。数据未缩放以保留基因表达的原始称重，并且由于大多数隔室中混杂参数的影响较低（即增殖评分和线粒体基因含量），因此没有进行回归。使用基于归一化分散体的扫描默认设置（由器官批次）确定聚类的高度可变基因，得出1,291个基因以进行进一步分析。在这些基因的基础上，使用默认的Scanpy设置进行了主成分分析。根据30个主要组件和20个邻居计算邻里图。使用Leiden算法（Leidenalg软件包，v.0.9.1）进行聚类，分辨率为r = 0.7，并使用默认的Scanpy设置计算了UMAP维度降低。 　　使用默认设置在Scanpy中计算基因签名分数。Relevant gene signatures were as follows: genes upregulated by ex vivo B cells 2 h after exposure to CD40L40: Tnfaip3, Bcl2l1, Bcl2a1a, Gadd45b, Gadd45g, Fas, Slc16a1, Slc19a1, Prps1, St3gal6, Hmgcr, Ldlr, Fasn, Ccnd2,Stat5a, Nfkb1, Myc, Irf4, Cr2, Cd44, Il2ra, Ebi3, Lilrb4a, Fcer2a, Gpr65, Il1b, Traf1, Nfkbia, Nfkbib, Marcksl1, Icam1, Cd83, Jarid2, Bhlhe40, Gm4736* and Tfg.小鼠脾脏GC光B细胞的基因特征41,42：CD52，CD83，HSPD1，RAN，MIF，ATP5B，MYC，MYC，DKC1，LRRC58和H2-AA。用星号注释的基因是已发表签名的一部分，但在我们的数据集中未检测到。 　　对于细胞轨迹推断，使用速度（v.0.17.17.17）Run10x Pipeline59从细胞游侠对准序列中生成剪接/未填充的读数。使用SCVELO（v.0.2.5）60将数据与上述基因表达分析合并，并使用Unitvelo（V.0.2.5.2）61得出轨迹61基于1,500个顶部可变基因的模型。对于轨迹推断，分别从数据集中排除了高度增殖和转录活性的骨髓簇6和7。 　　根据制造商的说明，将来自原发性和继发性淋巴组织的单细胞悬浮液富含CD19，然后根据制造商的说明进行表面染色。为了从百里香和骨髓分选择CD19+细胞，我们根据IgM和IgD的表达定义了三个不同的组。双阳性细胞定义为活的CD19+B220+IgM+IgD+细胞。此外，我们分离了CD19+B220+IgM+IgD-和双阴性B细胞，定义为CD19+B220+IgM-IgD-细胞。为了从次级淋巴组织中分类CD19+细胞，我们根据其成熟状态定义了四组。幼稚的B细胞被指定为活的CD19+B220+IGD+CD21+CD95 -GL7-细胞，GC B细胞为Live CD19+B2220+B220+CD95+GL7+细胞，边缘区B细胞为Live CD19+B220+B220+IGD -CD21+CD21+CD95-GL7-细胞，CD19+B220+IGD -CD21 -CD95 -GL7-细胞。如上所述，立即分离出来自排序细胞的RNA并处理进行qPCR分析。 　　将来自次级淋巴组织的单细胞悬浮液用于实时CD19+细胞的FACS置液，并在37°C和5％CO2下培养2天，然后将RNA分离为qPCR。为了刺激，包括50 µg mL-1抗小鼠CD40（FGK4.5，生物XCELL）的不同组合，20 ng µl-1重组IL-21（Miltenyi Biotec）（Miltenyi Biotec），10 µg ml-1 goat-1山羊抗小鼠IgG+MigG+IgM（H+L）使用了杰克逊免疫研究）和1 µg mL -1 LPS。 　　人类扁桃体组织是从慕尼黑大学医学院技术大学医学院的Klinikum Rechts der Isar的Otorhinolaryngology系从常规的扁桃体切除术中获得的。由新鲜收集的人扁桃体组织制备单细胞悬浮液并冷冻。简而言之，将扁桃体组织切成小块，并通过细胞滤网分解。洗涤后，根据制造商的说明，使用Histopaque-1077 Hybri-Max（Sigma-Aldrich）梯度离心纯化细胞。将来自人类扁桃体的单细胞悬浮液用于实时CD19+细胞的FACS级别，并在37°C和5％CO2培养2天，然后将RNA分离为qPCR。对于分类不同的B细胞子集，我们根据CD38，CD27，IGD和CD10的表达定义了三个不同的组。人天真的B细胞被定义为活的CD3 -CD19+CD27 -CD38+细胞，记忆B细胞为活的CD3 -CD19+CD27+CD27+CD38-细胞和GC B细胞，而GC B细胞为Live CD3 -CD19+CD27+CD27+CD38+细胞。如上所述，分离出来自分类细胞的RNA并处理进行qPCR分析。 　　对于人类CD19+细胞的体外刺激，我们使用了配备由D. Hodson62提供的配备膜结合CD40L（CD40LG）的永生化卵泡树突状细胞（YKL）的共培养系统。为活的CD3-CD19+CD27-细胞，将缺乏CD15的Macs珠珠珠止血细胞facs facs置为facs，并在辐照的YKL细胞层上播种5天。为了可比性，还将FACS分级的细胞种植在对照YKL细胞中，用空载体而不是CD40L载体转导。5天后，如上所述分离RNA并处理进行QPCR分析。 　　为了测试AQP4特异性召回响应，我们使用了基于T细胞杂交瘤细胞系（A5细胞）建立的系统63，该系统配备了与NFAT链接的GFP报告基因，这是IL-2信号通路的下游转录因子64。我们用高亲和力AQP4反应TCR（克隆4或克隆6）转染了这些细胞，以测试APC的APC，以便其内源性呈现AQP4。在下面的“具有AQP4特异性TCRS的A5细胞转导的A5细胞”中描述了AQP4-TCR转导的A5细胞的产生。作为对照，我们要么外源添加p41（0.3和1.0 µg mL-1），抗CD3（1 µg mL-1）和/或抗小鼠MHC-II（I-A和I-E）阻塞抗体（5 µg ml-1）。通过流式细胞仪分析，我们在20-24小时后确定了NFAT – GFP+细胞的分数。 　　使用Ampurexp珠（Beckman Coulter），将总RNA从FACS分级的全胸膜B细胞和胸腺B细胞亚群中分离。如先前所述，进行了poly（a）-RNA的批量序列准备。65。简而言之，使用含有条形码的寡-DT引物，独特的分子标识符（UMIS）和适配器，使用最大值RT聚合酶（Thermo Fisher Scientific，EP0742）生成每个样品的条形码cDNA。通过模板开关（TSO）扩展了cDNA的5'末端，并用与TSO位点和适配器结合的引物扩增全长cDNA。NEB Ultraii FS试剂盒用于碎片cDNA。末端修复和A尾后，将TRUSEQ适配器连接，并最终使用具有Illumina P5和P7悬垂的引物扩增3'端片段。与以前的描述65相比，P5和P7位点被交换以在Read1和Read2中的条形码和UMIS中启用测序，以实现更好的群集识别。该库是在NextSeq 500（Illumina）系统上测序的，在Read1中，cDNA为65个循环，并在read2中为条形码和UMIS进行了19个循环。使用已发布的Drop-Seq管道（V.1.12）处理数据，以生成样品和基因的UMI Tables66。参考基因组（GRCM38）用于比对。根据Gencode版本M25使用了成绩单和基因定义。 　　合并了同一库的两个单独测序运行的原始计数，并删除了非重叠的基因。使用EDGER软件包（V.3.40.2）67进行差异表达分析。在排除低表达基因（即至少4个样品中未达到100次计数的表达阈值的基因）之后，拟合了负二项式模型。使用FDR校正调整所得的P值以进行多次测试。为了增加功率，我们将分析限制在血清抗体组中的基因43中。如果基因的假阳性概率少于5％（PADJ <0.05），则认为它们是差异表达的。使用FactoMiner软件包的PCA函数对日志转换计数（log [cpm]）进行PCA。使用DESEQ2软件包（v.1.40.2）68和GSEA v.4.3.2 Software69,70与MSIGDB（v.2023.1）一起，对未过滤的DESEQ2进行了基因富集分析（GSEA）进行了归一化计数数据。询问的基因集源自细胞类型特征基因集的M8集合。分析以置换型表型和0.25的FDR进行。 　　含有高亲和力AQP4特异性TCR的逆转录病毒是通过磷酸钙沉淀的铂-E病毒包装细胞带有逆转录病毒载体（PMP71，D。Busch的礼物）的。为了产生后源性小鼠，从胫骨和股骨中收集了8-20周龄CD45.1 +/-×rag1 - / - 小鼠的骨髓。红细胞裂解后，用抗小鼠LY6A/E（SCA-1，1：300）和抗小鼠CD3/CD19（1：300）抗体染色单细胞悬浮液。用小鼠IL-3（2 ng ML-1），IL-6（50 ng ml-1）和SCF（50 ng ml-1）扩展FACS分级的SCA1+CD3-CD19-干细胞3-4天。通过脊柱型实现了扩展的干细胞的逆转录转导71。简而言之，将400 µL的铂 - E上清液在3,000g的3,000g后32°C下在32°C的后蛋白涂覆的48孔板中离心2小时。然后，除去200 µL的培养基，并用膨胀的干细胞填充到每400 µl的50,000个细胞的最终浓度。培养2天后，将转导的干细胞注射到受辐照的受体小鼠中。 　　为了评估体内AQP4特异性胸腺细胞的阴性选择，通过嫁接含有较大标记的RAG1 - / - 骨髓来培养的骨髓的混合骨髓嵌合体以及从WT或AQP4δB鼠（4：4：4：4：4：4：1）AQP4 - / - 受体，因此可以在同一宿主小鼠中比较来自多克隆和后源性（AQP4特异性）胸腺室的胸腺囊肿的成熟胸腺。该设置还确保了来自多克隆和后源性（AQP4特异性）胸腺室的成熟胸腺细胞遇到具有WT或AQP4缺陷B细胞的胸腺环境。如前所述，产生AQP4 TCR后源性小鼠。分离来自互补供体的干细胞，在注射前与后体和后源性室混合。移植后5至6周对重建进行了测试。 　　为了表征GC反应，用含有50 µg全长AQP4或重组人MOG蛋白的200 µL乳液免疫小鼠。在免疫接种之前（第-1天）以及第10天和第21天收集血清。在第21天，将小鼠安乐死以进行进一步分析。在用4％PFA灌注小鼠之前，将一半的排水淋巴结和脾脏进行流式细胞仪分析。分离出脾脏的其余一半和排水淋巴结以进行组织学。使用活的CD3+CD4+PD-1+BCl6+细胞的流式细胞仪分析对TFH细胞进行定量。通过对BCL6的免疫反应性和通过活细胞仪分析实时CD3 -CD19+B220+B220+CD95+CCL6+细胞对GC B细胞进行组织学定量。 　　为了检测蛋白质免疫小鼠血清中的抗AQP4或抗MOG抗体，使用了基于细胞的流式细胞仪测定法72,73。将血清在RPMI 1640生长培养基中稀释（1:50），并将每个孔中的30,000 LN18AQP4或LN18-MOG细胞添加到96孔板中。作为对照，每种血清都在LN18CTRL细胞上测试（用空载体转导）。将盘子在轨道振荡器上的冰上孵育25分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次。为了对LN18细胞结合的小鼠IgG染色小鼠，将50μL的稀释（1：100在洗涤缓冲液中）Alexa-Fluor-488标记的山羊抗小鼠IgG H+L（Life Technologies，Thermo Fisher Scientific）添加到每个孔中。在冰上孵育25分钟后，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次。 　　当比较两个以上的人群时，使用单向障碍和事后测试对细胞频率测量和细胞数量进行了统计评估。如图传奇所示，使用了双向方差分析，然后进行了事后多重比较测试。计算胸腺CD4 SP和胸腺B细胞的分数计算相关性和线性回归。使用Kaplan – Meier分析计算EAE发病率，并通过对数秩检验（Mantel – Cox）分析P值。使用Mann-Whitney U检验比较免疫时的年龄，疾病发作日，EAE评分峰值和EAE累积评分。p <0.05被认为很重要。计算和生成图是使用Graph Pad Prism V.10.9.0（GraphPad），Rstudio（V.2023.06.01）和Python（V.3.9.16）进行的。使用Adobe Illustrator 2022（V.26.0.1）制备数字。 　　补充表2中提供了广泛的材料和试剂清单。 　　使用visiopharm（V.2023.1）创建了代表小鼠基里米中CD19密度的热图。首先，根据标记强度鉴定并概述了具有高表达EPCAM的组织区域。基于DAPI和CD19表达鉴定CD19+细胞。为了产生热图，考虑了在50 µm半径内重叠的CD19+细胞。使用Adobe Photoshop CS6（V.13.0）制备数字。 　　从Zenodo（https://doi.org/10.5281/zenodo.5500511）下载了带有预估的UMAP和细胞类型分类的注释的矩阵文件（H5AD）。阳性细胞的分析中包括所有具有大于零的AQP4或AQP4表达的细胞。An MHC-II score was generated in SCANPY to summarize mouse H2-Aa, H2-Ab1, H2-Eb1, H2-Eb2 and human HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRA, HLA-DRB1 and HLA-DRB5表达。在数据集的.OBS数据框架“单元格类型”和“ Anno_level_fig1”中存储的预先注销的分类分别用于鼠标和人类细胞类型标记。 　　如前所述71所述，含有AQP4特异性TCR的逆转录病毒是通过用逆转录病毒载体（PMP71）的铂-E病毒包装细胞（PMP71）产生的。2天后收集含有病毒的上清液，离心以处理细胞碎片，然后立即用于脊柱，或在4°C保持最多4周。为了进行脊柱，将400 µL的铂-E上清液以3,000g的48孔板在32°C下离心2小时。然后，除去200 µL培养基，并用A5细胞填充到每400 µL的最终浓度为50,000个细胞。培养2天后，通过流式细胞仪分析测试了转染A5细胞中TCRα和β变化链的表达。然后，通过p41脉冲APC刺激FACS分类，富含表达各自TCR的两个链的A5细胞，并使用流式细胞仪刺激后测试了其NFAT-GFP表达。 　　Dereg小鼠为诱导型Treg细胞耗竭提供了有效的体内模型48。以前在EAE中研究了该模型，需要对免疫程序进行一些修改74。与早期描述的免疫方案相反，小鼠在免疫腹膜内（静脉内第0和第2天静脉内静脉内静脉注射50 ng）和0.5 µg白喉毒素腹膜内（i.p.），在免疫接种后的第5和第6天两天，在第5天和第6天进行了0.5 µg。 　　通过CD4 MACS珠富集（Miltenyi Biotec），从未经操纵的AQP4ΔB小鼠中分离出成熟的CD4+ T细胞。总共注入了5×106 T细胞。进入TCRA - / - 小鼠。然后，转移后1天，如指示的那样，对TCRA - / - 受体小鼠进行免疫，并分析了EAE发作后2天通过P41 –I-I-I-I-I-AB Tetramer染色在转移的T细胞库中的AQP4特异性T细胞频率。 　　将总共​​5×106 FACS分类的CD4+ T细胞静脉注射到TCRA - / - 小鼠（第0天），然后在两个侧面均具有含有PBS和CFA的乳液（第1天）的皮下免疫。在免疫后第32天对小鼠进行安乐死之前，对小鼠进行评分并称重。心脏血液收集后保存血清，并测试了自身抗体。 　　为了筛选自身抗体，使用二级抗小鼠IgG（H+L）AF488抗体（Thermo Fisher Scientific）对淋巴细胞缺陷的RAG1 - / - 小鼠的组织学冷冻切除术进行了测试。通过冰冷的PBS，然后是4％PFA，通过顺序心内灌注对小鼠进行安乐死。然后将解剖的器官嵌入到组织中的O.C.T.化合物并立即用液氮冷冻。用预冷的丙酮（-20°C）固定1分钟后，随后用正常的山羊血清（PBS中的30％稀释）固定10分钟，将10 µM冷冻切除术与保留的小鼠血清（1:50）孵育1小时。接下来用二级抗小鼠IgG（H+L）AF488抗体（1：500）处理样品30分钟。最后，将切片洗涤并用延长的金抗抗固定试剂（Thermo Fisher Scientific，p36931）安装。使用Leica Bond RXM设备进行染色，使用键洗溶液（Leica，AR9590）进行所有洗涤步骤，并使用键键抗体抗体稀释剂（Leica，AR9352）制备所有稀释。 　　用半定量方法确定AQP4损失，以计算相邻CNS病变的程度。使用CD45+细胞的阳性核检测及其参与区域自动测量CNS病变的程度。AQP4信号是使用QuPath的阳性像素计数算法在相邻区域中计算的，其定义半径为100 µm至CD45+浸润（感兴趣的区域）。出于比较的原因，将AQP4信号标准化为CNS病变的程度。所有注释均以盲目的方式进行。 　　无花果的一部分。2和4，以及扩展的数据图2。使用Servier Medical Art的图片绘制了3、6、7和9。Servier的Servier Medical Art由3.0获得Creative Commons许可CC许可。扩展数据的零件图9a是使用Biorender创建的。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。