诱变和eCDNA的相互作用塑造了尿路上皮癌的进化

　　所有实验程序遵循批准的指南，并由WCM的机构审查委员会（IRB）批准。根据IRB批准的方案签署了知情同意的招募患者：WCM/纽约 - 长主教（NYP）IRB肿瘤生物群体方案 - 0201005295；GU肿瘤生物库-1008011210;尿路上皮癌测序-1011011386;和综合癌症特征（基因组和转录组分析-1007011157，以及精密医学-1305013903）。该研究对WCM/NYP的所有晚期UC患者开放。收集了来自活检，膀胱切除术和肾上腺切除术的新鲜冻结和FFPE组织。WCM/NYP的董事会认证的泌尿生殖器病理学家（J.M.M.）审查了所有病理标本。对临床图表进行了审查，以记录患者人口统计学，烟草使用，癌症家族史，并发癌症，治疗史，解剖部位，病理学等级和使用肿瘤，节点，转移（TNM）系统。 　　WCM/NYP的Englander精密医学研究协议已建立，以促进针对分子诊断和治疗剂的个性化医学。为患者提供了参加IRB批准的快速尸检计划的选择。此外，患者的近亲在尸检前还提供书面同意。遵循系统的尸检方案，以收集正常和恶性的新鲜组织，分配样品，以进行冻结或福尔马林固定。目的是最大化用于研究目的的组织量。收集组织后，根据WCM尸检协议进行尸检。在这项研究中，收集了来自多个位点的组织，在降血石和曙红评估和冰冻幻灯片注释后提取了DNA用于WGS。 　　按照制造商的说明，使用KAPA Hyper PCR+图书馆准备套件制备WGS图书馆。在图书馆准备之前，使用PROCR修复混合物（NEB）修复FFPE样品，然后进行其他DNA定量。对于图书馆准备，使用Covaris Le22​​0剪切DNA。DNA片段被末端修复，腺苷酸化并结合到Illumina测序适配器。图书馆经历了两个结构后的珠子清理，PCR扩增和最终的PCR珠子清理。使用KAPA QPCR库定量套件（Roche）和片段分析仪（Agilent）验证了最终图书馆质量。使用2×150 bp循环对图书馆进行标准化，合并和测序。 　　纽约基因组中心（V.6）体管道55用于对齐数据并调用变体。简而言之，将测序读数与BWA-MEM（v.0.7.15）56对齐GRCH38。使用NYGC短期标记（v.2.1）（https://github.com/nygc.com/nygc-c.short-alignment-marking）去除短对齐，并与gatk fixmateInformation添加Mate-Pair信息（v.4.1.0）57。将单个车道BAM与Novosort Markduplicates（V.1.03.01）同时分类，然后是GATK BQSR。使用Mutect2（gatk v.4.0.5.1）58，strelka2（v.2.9.3）59和柳叶刀（v.1.0.7）60来称呼SNV，多核苷酸变体和indels。使用SVABA（V.0.2.1）61，MANTA（V.1.4.0）62和Lumpy（V.0.2.13）63称为SVS，svaba用于Indels和SVS。使用Splazer（V.1.1）64量化了对SVS的分读支持。用GATK HaplotypeCaller（v.3.5）在匹配的正常样品上调用种系变体，并用GATK VQSR过滤99.6％。杂合种系变体的位置用于计算肿瘤样品中的B等位基因频率。变体在呼叫者之间合并，并使用emembl（v.93）65，宇宙（v.86）66，1000 genomes（phase3）67，clinvar（201706）68，polyphen（v.2.2.2）69，69，69，sift（v.5.2.2）70，fathmm（v.2.2.2.2.1）71，d.2.1，d.2.1，gnomad。（v.150）73使用变体效应预测变量（v.93.2）74。Somatic variants that occurred in two or more individuals in our in-house panel of normals were removed, as well as SNV/indels that had minor allele frequency ≥1% in 1000Genomes or gnomAD, and SVs overlapping with DGV (2020-02-25 release)75, 1000Genomes or gnomAD-SV (v.2.0.1)76.SNV/INDEL带有肿瘤VAF <0.0001, normal VAF >0.2，深度 <2 in either the tumour or normal sample, and normal VAF greater than tumour VAF were filtered from the final callset. SNV/indels with support from two or more callers were marked as high confidence. SVs with support from two or more callers or one caller with split-read or CNV changepoint support were marked as high confidence. Variants detected by the somatic calling pipeline in the FFPE normal tissues were removed from the tumour samples. None of the 77 remaining tumour samples was excluded from the analyses due to the absence of ABOPEC mutational signatures. 　　Purity and ploidy were estimated for each sample using AscatNGS (v.4.2.1)77 and Sequenza (v.3.0.0)78. Estimates were manually reviewed and chosen based on VAF, B-allele frequency and read depth fit. Owing to low purity, six tumours were excluded from downstream JaBbA analysis. 　　Our study included 83 samples: 77 histologically proven UCs and 5 morphologically normal urothelial samples from 50 patients. Five normal urothelium samples were only included in the comparisons between primary and metastatic tumours and normal urothelial samples. The bladder cancer (primary bladder adenocarcinoma) sample from patient WCMIVG101 was only used for ONT long-read WGS. This was a cross-sectional genomic cohort study of patients with advanced UC. Basic covariates (including sex, age at diagnosis, smoking status, highest stage, primary or metastatic tumour, site of tumour collection and platinum-based chemotherapy status) are listed in Supplementary Table 1. 　　For patients with multiple samples, a union of ‘HighConfidence’ somatic SNVs and indels across all the patient’s samples was generated. Pileup (v.0.15.0) (https://github.com/pysam-developers/pysam) was then run on tumour and normal BAM files to compute the counts for variants present in the union variant call format (VCF) file that were missing from each sample’s VCF. Variants that had a VAF >然后将0救出并添加到样品VCF中。由此产生的“联合VCF”用于进一步加工。 　　使用R封装解构物（v.1.9）79进行突变签名拟合。输入高度信号变体，宇宙（v.3.2）特征（https://cancer.sanger.ac.ac.uk/signatures/)66用作参考。参数“ contexts.need = true”和“签名。此外，包括从我们的APOBEC3G转基因小鼠Model7中衍生出的SBS.A3G，以适合患者肿瘤的特征。在签名拟合后，对于每个SNV，我们计算了一个78个后验概率的通道（对应于每个SBS参考特征），即突变是由给定的宇宙签名引起的（类似于参考文献80）。丢弃低于0.5的后验概率后，选择了最有可能的签名。如果三核苷酸上下文不是前5个参考特征峰之一，则将分配丢弃。APOBEC (SBS2 and SBS13) and platinum chemotherapy (SBS31 and SBS35) were treated separately based on previous knowledge (SBS2: C>T; SBS13: C>A, C>G; SBS31: C>T, T>A; SBS35: C>A, C>G, C>T, T>A).然后，我们使用患者临床数据来完善铂化化疗分配。对于未接受铂化疗的患者的样本，SBS31和SBS35突变分配被删除。对于具有多个样本的患者，SBS31和SBS35突变分配被去除以进行化学疗法和化学后样品中发生的突变。但是，如果在一个化学后样品中未分配突变，但在同一患者的另一个化学后样品样本中被分配给SBS31或SBS35，则将重新分配第一个样本中的突变。 　　使用同一患者的匹配肿瘤确定正常尿皮上皮上变体的突变特征分配。使用在匹配的肿瘤中具有SBS2或SBS13分配的位置，在正常的卵皮上运行堆积（V.0.15.0）（https：//github.com/pysam-developers/pysam）。将VAF> 0的变体计算为在正常尿路上皮中分配给给定突变特征的变体数量。 　　为了研究衰老的时间（SBS1），APOBEC（SBS2和SBS13）和化学疗法（SBS31和SBS35）突变过程，我们计算了如前所述的签名克隆性折叠变化8。为了计算每个化学疗法样品的克隆与克拉斯下褶皱变化，我们将所有突变timer12克隆类别（早期克隆，晚期克隆，克隆，克隆（Na），亚克隆）汇总，并将克隆突变的比例分配给了分配给同一签名的亚克隆突变的比例。同样计算出早期和晚期变化。将突变计数用于各自的宇宙特征。仅包括具有足够纯度上游JABBA分析的样品。 　　对于图1B，我们包括n = 12例接受铂化疗的多个样品的患者。截短突变是树中所有样品共享的节点变化，而叶子突变是每个样品独有的节点变化。为了证实Apobec签名主导的早期截短节点的观察结果，而化学疗法相关的特征在系统发育树中占主导地位，我们计算了每个患者的变体变化的变化，通过将与每个患者的突变型相关的变异分数分配给每个患者的变异分数，以使每个患者在毛囊中，每个患者在毛囊中，由每个患者中的患者在fract中的病人中的病人。为了避免除以零，在折叠更改计算之前添加了1个变体的伪计数。 　　染色质修改基因的列表是从Reactome81和以前的出版物中策划的14,82,83。删除了重复的基因。CGC基因列表在“化学疗法引起的突变的Oncoprint”部分中进行了描述。值得注意的是，在检查的743个CGC基因中，有47个基因与259个染色质修饰基因重叠，与癌症中染色质反射基因突变的频繁观察到了频繁观察。对照基因从CGC基因列表中的500个基因和染色质修饰基因中随机取样（补充表5）。Ensembl变体效应预测因子（VEP）74用于为检测到的变体分配功能性影响预测，而R封装突变二聚体（V.1.00.2）12 12用于计算每个变体的克隆性和CCF（请参阅“突变时间和CCF计算”部分。分析了VEP预测的中等影响和高影响力变体，以优先考虑具有功能后果的早期尿路上皮突变。 　　计算诱变速度（SBS1），APOBEC（SBS2，SBS13和DBS11）和铂化学疗法（SBS31，SBS35和DBS5）签名计算诱变速度（SBS1），APOBEC（SBS2，SBS13和DBS11）的诱变速度。从解构的Sigs79拟合的特征中的突变计数除以诱变过程的暴露时间（月）。衰老和化学疗法的估计暴露时间分别在样本收集日期和出生日期或初始化疗治疗日期之间。对于初始诊断日期未知的患者，假定是在最早收集组织日期之前的1年。从诊断的出生和诊断日期开始的持续时间是根据诊断和样本收集日期的年龄进行追溯计算的。对于APOBEC，假定暴露时间是从UC诊断日期前10年的样本收集时间，正如我们预期的那样，APOBEC诱变发生在UC诊断之前。给出了所有样品的一个伪签名计数，以防止在没有衰老签名贡献的样品中除以零。零APOBEC签名贡献的样品和化学疗法贡献零疗法的化学疗法样品被排除在计算之外。平均有多个样本的患者中每个突变过程诱导的速度。通过将APOBEC和化学疗法速度除以老化的速度来计算折叠变化。 　　为了解决顺铂治疗引起的突变的生物学意义，我们检查了分配给SBS31和SBS35的编码区域中的突变，这些突变是由先前对基于铂基化学疗法的治疗引起的。从癌症基因共识（CGC V.95 Tier 1和2基因）和TCGA 2017 BLCA驱动基因中策划CGC基因，不包括BRCA2，KMT2C和KMT2D的FLAGS（通常是突变的基因）85，将其恢复到基因列表中。 　　我们研究了使用预定义的基因列表的驱动基因改变与SV类型的存在之间的关联（补充表5）。对于基因和SV类型的每种组合，我们使用Fisher的测试进行了关联测试， <0.25. The tested associations included moderate to high impact SNVs/indels, amplifications, a combination of amplifications and SNVs/indels, homozygous deletions and a combination of homozygous deletions and SNVs/indels. 　　We used three databases for analysis: FANTOM5 for promoters86 (209,911 promoters, 4.2 MB), FANTOM5 for enhancers87 (63,285 enhancers, 18.6 MB) and previously described super-enhancers88 (8,589 super-enhancers, 468.5 MB, with the union taken across 86 cell types). The initial step involved overlaying all SNVs onto these features, disregarding mutational signature assignment, for a comprehensive starting point in our analysis. We then conducted FishHook analysis to identify any regulatory elements that are mutated more than expected based on background. We re-used covariates from FishHook SV analysis (see the section ‘Regions of recurrent structural variation’), and used the union (ignoring strand) of promoters, enhancers and super-enhancers as the list of hypotheses to test. Each patient could only contribute one mutation per hypothesis. We included local mutation density as a covariate and kept the FDR cut-off at 0.25. 　　Enrichr refers to an integrative web-based search engine of various gene set libraries and methods to compute gene set enrichment with interactive visualization of the enrichment results89,90,91. In this study, we interrogated the NCI-Nature 2016 pathway database to search for pathways showing a significant increase in the number of mutations assigned to platinum chemotherapy-induced SBS31 and SBS35. The P value was computed from a two-sided Fisher’s exact test, and pathways with adjusted P ≤ 0.2 are reported. The enriched pathways were visualized by Appyter available at Enrichr. 　　The R package MutationTimeR (v.1.00.2)12 was run using the union of somatic variants, allele-specific CN output from JaBbA, patient sex information and previously estimated purity values. Parameter n.boot was set to 200. MutationTimeR infers a multiplicity for each mutation and assigns a timing based on the multiplicity and the allele-specific CN configuration at that locus. Using MutationTimeR multiplicities, CCF was computed as previously described92. 　　Phylogenetic trees were generated using LICHeE (v.1.0)93 for each patient with multiple samples. LICHeE was run with a variant-by-CFF matrix as input, the ‘maxVAFAbsent’ argument of 0.0, the ‘minVAFPresent’ argument of 0.5, the ‘maxClusterDist’ of 0.2, and in cell prevalence mode (-cp). The top-scoring tree was selected. The variants in each of the resulting nodes of the phylogenetic tree output were then fed through deconstructSigs as described above to estimate a set of mutational signature proportions for each node. 　　Genes with evidence of positive selection were detected using the R package dndscv94,95,96 using default parameters and GRCh38-specific reference data as supplied by the developers. As per the developer’s instructions, mutations shared across multiple samples from the same patient were only listed once. This method of calculating the dN/dS ratio adjusts for other confounders of clonal selection, such as large gene sizes and a high regional mutation rate97. The following classification was used: dN/dS = 1, neutral selection; dN/dS >1，正选择；DN/DS< 1, negative selection. Higher missense and nonsense dN/dS ratios indicate a clonal selection of oncogenes and tumour suppressor genes, respectively. 　　Read counts were corrected for GC percentage and mappability in 1-kb bins using fragCounter (https://github.com/mskilab/fragCounter) for all tumour and normal samples. A coverage panel of normal was built from the normal samples and used to denoise the tumour coverage data using dryclean (commit bda8065)98. Denoised tumour coverage profiles, B allele frequencies and high-confidence SVs were used as input to JaBbA (v.1.1)2, an algorithm that integrates CNV and SVs into a junction-balanced genome graph, computing integer copy numbers for both. Default parameters were used, except for the slack penalty, which was increased to 1,000. Simple inversions, translocations, duplications and deletions, as well as TICs, quasi-reciprocal pairs, rigma, pyrgo, tyfonas, BFB cycles and DMs, were called on the junction-balanced genome graph using the JaBbA companion R package gGnome (commit c390d80)2. Using the integer CN as output by JaBbA, we computed the fraction of genome altered, defined here as the proportion of autosomes not in a neutral copy state, as defined by sample ploidy. For samples with an intermediate average ploidy (fractional value of 0.4–0.6, for example, 3.5), the copy-neutral state was set as the closest two integer values (for example, for a ploidy of 3.5, the copy-neutral states would be 3 and 4). Otherwise, the copy-neutral state was set as the rounded ploidy. 　　A Gamma–Poisson model, as implemented in the R package FishHook (commit 06e3927)99, was used to discover regions of recurrent SVs. The genome was partitioned into 100-kb non-overlapping bins, and the union of breakpoints from each patient was used as input as previously described100. Regions overlapping intervals of mappability <1 and centromeres >25% were excluded from the analysis. Covariates were added to model the background mutation rate, including the following: 　　A FDR-adjusted (Benjamini–Hochberg) P value cut-off of 0.25 was used to nominate significant breakpoint hits. Cancer-related genes were from the COSMIC Cancer Gene Consensus102. 　　We noted that JaBbA does not impose any kind of cyclic constraint when calling high-level amplifications (for example, DMs, tyfonas and BFBs). To determine whether these events were ecDNA-forming SVs, AmpliconArchitect (v.1.2)17 was run using default parameters on tumour BAMs downsampled to 10x, considering only intervals with integer CNs greater than 4 (inferred by JaBbA) and longer than 10 kb. For two runs on which these parameters could not be applied, we used 10x downsample, CN >5和100-kb间隔。JABBA检测到的任何高级扩增与扩增的循环扩增子重叠为eCDNA形成SVS。 　　我们运行了具有默认参数的SigprofileClusters（V.1.1.2）103软件，以识别Kataegis loci，计算群集突变的样本依赖性固定距离，并要求Kataegis事件具有一致的VAF。kataegis事件完全包含在形成ECDNA的SV的足迹之内，被归类为Kyklonas。 　　作为确定作用于eCDNA的突变过程的相对贡献和时机的次要方法，我们通过VAF将eCDNA形成SV的SNV划分为三组（VAF ≤0.333，0.333，0.333，0.333< VAF ≤ 0.667 and VAF >每个样品0.667）。然后，我们按照上述和VAF组合进行解构，要求特定组合至少具有50个SNV。APOBEC和化学疗法诱变对ECDNA形成SV的相对贡献如图2F所示，并且在扩展数据中的所有突变过程图6A中。 　　从GitHub访问了先前研究22的扩增分析。样本来自TCGA和PCAWG数据集（基于其标识符，SA-XXXX或TCGA-XXXX）。分析了与CCND1基因组位置相对应的扩增子间隔的所有样品的样品条形码（染色体11：69455855-69469242）。然后将所得的扩增子间隔匹配，以通过AmplIconArchitect确定的放大事件类型（重排重新排列，圆形BFB或线性）。在宫颈癌中仅确定了一个CCND1扩增事件，而在B细胞淋巴瘤，胶质母细胞瘤，肉瘤，肾脏或结直肠癌中仅确定了一个CCND1扩增事件。从CBIOPORTAL检索具有CCND1扩增子的膀胱病例的CDKN2A和CCND1突变以及CN状态。在国家癌症研究所网站（https://gdc.cancer.gov/resources-tcga-users/tcga-code-tables/tcga-study-abbreviations）上列出了针对不同癌症类型的研究缩写。 　　与Grch38相比，Star Aligner（v.2.7.3a）104以两通道模式（-twopassmode Basic105）运行。使用Gencode（v.39）创建恒星索引用于剪接连接注释，悬垂= 99，仅包括规范染色体（染色体1-22，X，Y和M）。Gencode（V.28）用于基因定量。The GTF was filtered to include only genes from the following types (‘gene_type’ field): protein_coding, lincRNA, antisense, IG_LV_gene, IG_V_gene, IG_V_pseudogene, IG_D_gene, IG_J_gene, IG_J_pseudogene, IG_C_gene, IG_C_pseudogene,tr_v_gene，tr_v_pseudogene，tr_d_gene，tr_j_gene，tr_j_pseudogene，tr_c_gene。使用CellRanger（https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-gene-eppression/software/software/pipelines/pipelines/latest/advanced/advanced/references#mkgtf）执行此过滤。使用脚本Collapse_annotation.py（https://github.com/broadinstitute/gtex-pipeline/tree/tree/tree/master/gene_model）使用脚本collapse_annotation.py排除了注释为“ retaining_intron”的成绩单。进行这种过滤是为了避免因这些类别重叠的其他基因类型的基因（例如同一基因的伪代版本）的重叠而导致的计数，或者基因否则非重叠的基因除外，除了“ retained_intron”同一个类型。来自子读包（v.1.4.3-p1）中的特征捕获量的模块用于读取量化，对于非链接特定样本的链特异性样本和参数“ -s 0”的参数为“ -s 2”。SVA软件包（R V.4.1.3，SVA V.3.42.0）的模块COMBAT_SEQ107用于批处理校正。这些样品被视为基于PREP类型的四批批次，其“ totalRNA”或物理rRNA去除的2×2设计与“ mRNA”或“ mRNA”或Poly-A选择， 和特定于链特异性的特定于链。包括39个带有相应DNA的样品。从同一患者的同一肿瘤样品中提取DNA和RNA，除非肿瘤组织都不足以完成。deseq2（r v.3.6.1，deseq2 v.1.24.0）108用于批处理后的库大小归一化。DESEQ2还用于在没有获得CCND1 CN的样品与没有增益的样品之间执行差异表达。增益定义为CN相对于倍性的增益。 　　使用Fisher的精确测试（R v.4.0.0中的Fisher.test）确定CCND1扩增和纯合损失的共同存在。CCND1扩增定义为具有基因模态拷贝数（CN）大于样品倍或大于8的两倍。CDKN2A的纯合损失定义为具有零基因模态CN。在CCND1扩增中进行了单独的Fisher的精确测试，通过形成ECDNA的SV状态，并在整个队列中进行了分裂，将CCND1 eCDNA形成SV+与CCND1 ECDNA形成的SV sV进行了比较。 　　为了确定CCND1改变对临床结果的影响，我们查询了来自pan-Cancer Atlas109中的32种癌症类型的10,953例患者（10,967个样本）的数据，来自CBIOPORTAL（https://bit.ly/4cjayof）。在有10,622例可获得总生存数据的患者中，有2,128例患者发生了CCND1改变，包括CN增益和CN扩增。我们使用CBIOPORTAL的内置生存函数进行了生存分析。 　　与每个假定的CCND1 ECDNA形成SV相对应的JABBA扩增子足迹均相交，这产生了一个204 KB的基因组间隔（染色体11：69614476-69818943）。此间隔被上传为UCSC基因组浏览器101的自定义轨道。选定的其他轨道包括NCBI RefSEQ基因模型（发行2023-03-21），Fantom5转录起始站点峰86和H3K27AC，H3K4ME1和H3K4ME3 MARK来自Encode110。有关如何操作交互式浏览器接口的教程可在GitHub（https://github.com/mskilab-org/ggnome.js/blob/master/master/readme.md#the-ggnomejs-interface）上获得。 　　对于每个假定的ECDNA形成的SV（例如，JABBA称为Tyfonas，DMS或BFB重叠的扩增子结构循环呼叫），从完整的Jabba基因组图中提取了与扩增子相关的子学数据。然后，使用R Package GGNOME（提交C390D80）中的“ Peel”功能将每个扩增子分解为组成步行，并使用Junction CN进行排名步行。简而言之，“ Peel”尝试通过查找最大化某些连接功能的图（在此，JCN）的图表来迭代分解子图。对于每次迭代，排名最高的步行是从子图中“剥落”的，并且重复了该过程。 　　在为每个扩增子获得一组步行后，删除了含有少于八个中枢神经系统的基因组间隔的非循环步行和步行。然后将通过上述过滤器的每次步行与相关的扩增循环事件进行比较。然后保留了最好的重叠步行，而其他人则被丢弃。最后，选择以倒数重叠≥80％的步行，以Cycleviz（V.0.1.5）111（https://github.com/ampliconsuite/cycleviz）进行可视化。预设的灌木丛用于显示eCDNA重建中包含的癌基因。 　　使用Covaris G-Tube（Covaris，520079）将样品分散至10 kb。使用NEBNEXT伴随模块（NEB，E7180S）进行DNA修复和端PREP，在20°C下孵育5分钟，然后在65°C下5分钟。使用1×Ampure XP珠（Beckman Coulter，A63881）清理样品，并在具有80％乙醇的磁架上洗涤两次。在室温下，将牛津纳米孔连接测序试剂盒（ONT，LSK1114）的测序适配器和连接缓冲液连接到DNA末端45分钟。使用0.45×Ampure XP珠（Beckman Coulter，A63881）清理样品，在带有长碎片缓冲液（ONT，LSK114）的磁架上两次洗涤，然后在32 µL ELITION BUFFER（ONT，LSK114）中洗脱。通过将以下内容添加到洗脱器中：100 µL测序缓冲液（ONT，LSK114），68 µL载荷溶液（ONT，LSK114）和0.5 µL测序的扎件（ONT，LSK114）来制备测序文库。使用Promethion Sequencer在Promethion（R10.4.1）流动池上运行样品。测序运行是使用Minknow软件（V.23.07.12）操作的。在高精度（HAC）模式下进行实时基础电话。读取N50为12,186 bp，平均覆盖率为58倍。 　　将ONT读数与miniMAP2（v.2.26 -r1175）112对齐与GRCH38对齐，带有标志-a – l - d -d -cs -x -x map -inm -the，并与samtools（v.1.18）113进行坐标。使用SamTools将重叠的读取重叠的放大区域提取到FastQ中，并用作输入中的组装。共有196,924个长的读取CCND1 eCDNA参考坐标与N50 10,087和平均覆盖率为1,403×。GRCH38 ALT CONTIG CHR11_KI270827V1_ALT重叠了一个感兴趣的区域之一，并且有许多与它对齐的读数，而不是染色体11上的相应基因座，因此这些读数包含在相关放大器的组件中。读数与Flye（v.2.9.2-B1786）114在元基因组学模式下，–NANO-HQ设置和–Read-Error设置为0.03，如ONT Q20+化学性质所建议。使用了一轮抛光。组装后，对FLEE组装摘要进行了审查，以确认组装了圆形重叠群。使用MiniMAP2和组件对齐预设-AX ASM5映射组装的重叠群回到GRCH38，以确认参考基因组上的组装足迹与使用Illumina测序检测到的扩增子相匹配。 　　膀胱癌细胞系UMUC3（CRL-1749）和5637（HTB-6）和HEK293T（CRL-3216）购自美国类型培养物收藏。SF295细胞系购自Neuromics（SF-001）。细胞系UMUC3、5637和SF295通过制造商通过STR测试和/或形态验证。将UMUC3，SF295，5637和HEK293T细胞在EMEM（ATCC），RPMI-1640（GIBCO）（GIBCO）（GIBCO）（sf295和5637）和SF295和5637）和DMEM（GIBCO）中的EMEM（ATCC）中的37°C和5％CO2孵化器中孵育。10％无四环素的FBS（Omega Scientific）。根据制造商的说明，对细胞对支原体污染的细胞进行了阴性。 　　我们在这项研究中使用的非整合慢病毒偶发载体具有均匀的长时间重复区域，可促进转导的CCND1 DNA的圆形化。由于该矢量是整合酶缺陷的，因此它建模了CCND1 ECDNA的外染色体外构型。最后，通过脚手架附着因子A（SAF-A）与核基质相互作用的支架/基质附着区域（S/MAR）序列可确保在有丝分裂过程中偶发组的自我复制和分配115。修改了M. Essand（Addgene，80391）116的PBMN（CMV-COPGFP-PURO-SMAR）质粒，已修改为包括MCHERRY-T2A-5'HA标签CCND1编码序列，由XBAI和Agei Sites合成，由集成DNA技术合成。在用XbaI和Agei消化后，将片段克隆到CMV启动子和Puro-Smar序列之间的PBMN载体中，使用T4 DNA连接酶（新英格兰Biolabs）（补充图1-5）。根据制造商的指示，该质粒被转化为一杆STBL3化学能力的大肠杆菌（Thermo Fisher Scientific），并使用Purelink Hipure质粒过滤器Maxiprep Kit（Thermo Fisher Scientific）收集。vectorBuilder产生了SHRNA CCND1敲低质粒（PLV-MCHERRY-T2A-PURO-U6-SHRNA）和SHRNA对照质粒（PLV-EGFP-T2A-PURO-U6-SCRAMBLE对照）。目标CCND1序列是TGTTGTAAGAATAGGCATTAA。通过Sanger测序验证质粒。 　　HEK293T细胞用感兴趣的质粒与PPAX2和PVSV-G质粒（addgene）转染。转染后每24小时收集含病毒的培养基，使用0.22 µm无菌50毫升管顶滤波器（Corning）进行过滤，并使用Lenti-X浓缩器（Takara）浓缩。浓缩的慢病毒用10 µg mL – 1聚甲烯（Millipore Sigma）用于转导。使用2 µg ML – 1嘌呤霉素（Gibco）选择转导的细胞。表达水平通过细胞周期蛋白D1的SDS -PAGE Western印迹验证。 　　将GFP标记的PBMN空载体UMUC3细胞与麦克里（MCHERRY）标记的PBMN CCND1 CCND1偶发ECDNA UMUC3细胞以1：1的比例共培养，最初播种成6孔板。同样，将争夺shRNA SF295细胞与CCND1敲低的SF295细胞共培养为1：1，最初播种成6孔板。播种24小时后，将共培养的细胞用1.5 µM顺铂或媒介物对照处理。将顺铂（在1 mg mL – 1的库存浓度下）新鲜溶解在培养基中，而不是DMSO中，以防止活性117的损失，并受到光的保护。然后将每个6孔板放在incucyte系统（Sartorius）中，以每6小时的现场跟踪GFP和MCHERRY信号。为了维持顺铂的选择性压力，在48小时后刷新了含有顺铂的培养基。对于重复，每个井中的25个斑点成像。监测96小时后，使用incucyte软件（Incucyte，2022b，rev2）对GFP和MCHERRY信号进行了定量。随后，计算MCHERRY和GFP信号面积的比率并归一化为基线（时间0）测量值。 　　在T75烧瓶中重复进行竞争测定实验，以进行单细胞RNA测序，以鉴定CCDN1偶发性ECDNA在选择性压力下转录曲线的影响。暴露于媒介物或顺铂（1.5 µM）的96小时后，使用荧光激活的细胞分选（BD FACSARIA II）分离了用GFP和MCHERRY标记的活细胞，随后由WCM基因组核心设备进行处理。10倍基因组学铬单细胞3'库RNA测序试剂盒用于构造库，并使用配对末端测序的Illumina Novaseqxplus进行测序，从而产生28 bp中的1个，并读取90 bp的2。 　　获得的测序数据通过10X CellRanger（v.7.1.0）进行了处理，并将“ - include-Introns”选项设置为false。具体而言，使用CellRanger MKFASTQ生成FastQ文件。为了进行对齐，我们使用了10倍预构建的GRCH38-2020-A人类参考。 　　使用CellRanger（V.7.1.0）处理了四个样品（媒介物– GFP，车辆 - 木屋，顺铂– GFP和顺铂– Mcherry）的原始单细胞RNA测序结果。用Scanpy（V.1.9.6）118读取每对样品（GFP和MCHERRY细胞）的矩阵文件（GFP和MCHERRY细胞），并在同一Anndata对象（V.0.10.3）119中串联。将细胞过滤至至少200个基因，线粒体计数低于20％。将基因过滤至至少三个细胞中的基因。转录组通过其总大小标准化，并缩放到10,000 UMI计数，并使用scanpy pp.highly_variable_genes函数选择具有batch_key ='sample'的高度可变基因。数据矩阵使用scanpy pp.log1p函数使用天然对数进行了对数转换。我们通过减去平均值并使用Scanpy PP.Scale函数减去平均值并除以标准偏差来缩放每个基因的基因表达。然后，我们使用svd_solver ='arpack'的Scanpy TL.PCA函数进行了主成分分析，并使用Harmony120进行了批处理校正。 　　通过从分子特征数据库（MSIGDB）中计算出E2F目标途径中所有200个基因的平均表达在每个单个单元中计算的E2F评分，121减去了使用Scanpy TL.Scanpy tl.score_score_score_genes函数减去参考基因参考基因的平均表达。我们使用pp.neighbors功能从scanpy构建了一个k-near的邻居图，将邻居的数量设置为25，并将主成分的数量设置为40。然后，在同一处理下，我们使用scanpy tl.umap函数应用了UMAP来降低尺寸降低尺寸降低（GFP和MCHERRY细胞）。为了可视化跨个体细胞的E2F转录因子活性，我们生成了由预估计的E2F评分编码的UMAP颜色，以区分低E2F活性状态。然后，我们将E2F分数绘制为框图，并使用Mann -Whitney测试在统计上比较每对样品之间的E2F分数。 　　为了比较每对样品（在同一处理下的GFP和MCHERRY细胞）之间的转录组曲线，我们使用Scanpy TL.Rank_Genes_Groups函数在每种处理下使用T-Test下在每种处理下使用T-Test下在GFP和MCHERRY样品之间进行了预处理的ANNDATA的差异表达。使用GSEAPY套件（V.1.1.1）和GSAPY PRERANK功能进行了显着上调和下调基因的基因富集分析。使用基于MSIGDB（MSIGDB_HALLMARK_2020）的签名的GSEA（Broad Institute）软件包的基因集富集分析（Broad Institute）软件包鉴定了差异调节的途径。基于NESS和相关的FDR Q值生成富集基因集的气泡图。 　　将UMUC3膀胱癌细胞播种在6孔板中，并培养24小时，然后在无血清培养基中过夜同步。然后用10％FBS或EMEM用10％FBS的EMEM用1.5 µM顺铂处理细胞，新鲜制备无DMSO。24小时后，收集细胞，重悬于200 µl冰冷的PBS中，并用3 ml的80％冰冷乙醇固定，同时涡旋以最小化结块，然后在-30°C下储存过夜。用PBS洗涤固定细胞以去除乙醇，并用DAPI溶液（1 mg ML – 1，BD Pharmingen，在0.1％Triton X-100 PBS中稀释1：1,000）在室温下在黑暗中在室温下30分钟。使用具有450/50 nm发射滤波器的405 nm激光器，在BD LSRFortessA流式细胞仪（BD Biosciences）上分析染色细胞。使用FlowJo（BD生物科学）分析了DNA含量，为此，细胞门控基于向前和侧散射以分离单个细胞，并使用Dean -Jett -Jett -Jett -Fox Model122计算细胞周期比例。 　　使用了CCND1（标记为绿色）和丝粒染色体11（标记为橙色）探针（帝国基因组学）。使用前，所有探针均已在中期扩散上验证。 　　为了评估外染色体CCND1定位，首先用Colcemid（0.1 µg ML – 1）治疗膀胱癌细胞系UMUC3和人胶质母细胞瘤细胞系SF295，以获得地层化合酶制备。加入低音溶液，然后将细胞固定在甲醇和乙酸中（3：1）。将固定的细胞放在显微镜载玻片上，并在室温下干燥1周。在一系列乙醇中脱水制备的载玻片。然后将探针添加到载玻片上，后者在可视化之前将其变性和杂交，洗涤，然后用DAPI对其进行反染色。当在染色体扩散外观察到绿色信号时，CCND1被认为存在于ECDNA中，而centromeric染色体11用作对照2。 　　为了评估基因扩增，在FFPE组织载玻片（厚5 µm）上进行了相互相鱼的CCND1枚举。CCND1扩增取决于CCND1基因信号（绿色）与丝粒信号（橙色）的比率高于两个。每个载玻片至少100个核得分。使用荧光显微镜（Olympus BX51； Olympus光学）进行分析。CyTovision（V.7.3.1）软件（Leica Biosystems）用于成像123,124。 　　通过在15厘米盘中生长至80％的汇合，并通过加入Karyomax Colcemid（10 µL ML – 1，Gibco）1-2小时来征收中期。用PBS洗涤细胞，胰蛋白酶（Gibco），并在200g下离心10分钟。我们添加了10 mL的0.075 m kCl预热至37°C，一次1毫升，两者之间的最大速度涡旋。之后，将细胞在37°C下孵育20分钟。然后，加入5 ml冰冷的3：1甲醇和乙酸（保持在-20°C），一次1 mL，然后通过忽略管子来重悬细胞。将样品在200克离心5分钟。添加固定剂，然后再进行离心重复四次。从15 cm的高度上将200 µL甲醇和乙酸中的两滴细胞滴入预热的载玻片上。将滑梯孵育过夜。 　　用RIPA缓冲液与添加的蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific）裂解细胞，以产生全蛋白裂解物。使用Pierce BCA测定法（Thermo Fisher Scientific）确定蛋白质浓度。裂解物在带有MOPS缓冲液的10％SDS -PAGE凝胶上运行，并使用IBLOT系统（Thermo Fisher Scientific）转移。兔抗周期蛋白D1（ABCAM，AB134175，1：2,000），小鼠抗α-微管蛋白（Millipore，05-829，1：1,000），鼠标抗RB（细胞信号技术，9309S，1：1,000），1：1,000抗P16INK4A（细胞信号技术，80772，1：1,000）抗体在4°C下在4°C下分别用作原代抗体。将HRP偶联的二级抗体（山羊抗兔，32260和山羊抗小鼠，32230，Invitrogen，1：1,000）在室温下孵育1小时。使用Luminata Poly HRP底物（Millipore）试剂开发印迹，在Chemidoc Imager（Bio-Rad）上成像，并使用Image Lab（Bio-Rad v.6.1.0）软件进行分析。 　　多氧霉素可诱导的慢病毒主链包括apobec3a cDNA，带有ha-tag和金星，带有连续表达的启动子，是M. D. Weitzmann125,126的礼物。慢跑病毒被引发到5637膀胱癌细胞系中，然后将金星阳性细胞的荧光激活细胞分选。通过使用HA-TAG抗体，通过SDS-PAGE WESTERTIT验证了APOBEC3A表达水平。 　　将细胞铺在室载玻片（热泡科科学）上，并用媒介物（DMSO）或强力霉素处理24小时。在室温下将细胞固定在4％多聚甲醛中10分钟。在PBS中用0.5％Triton X-100处理固定核，并在PBS中用2.5％的正常山羊血清封闭。小鼠抗磷酸抗酮H2A.X（SER139）抗体（细胞信号技术，80312，1：1,000）和兔抗磷酸RPA32（S4/S8）抗体（贝塔基fortis fortis Life Sciences，A300-245a，1：1,000）用作主要的抗体和Incubies的主要抗体。然后，Alexafluor 488偶联的驴抗兔抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories，711-545-152，1：1,000）和Alexafluor 594偶联的附属品抗体抗体抗体抗体抗体抗体抗体（Jackson ImpunoreSearch）使用（Jackson Impunoresearch Flaboyies）抗体并在室温下孵育2小时。通过在协议中省略原始抗体来包括负空白对照。之后，用DAPI（Invitrogen，p36962）将载玻片用延长的钻石抗固定剂密封。使用荧光显微镜（带有Plan Apochromat 633/1.4 Na油差分干扰对比目标； Carl Zeiss）的荧光显微镜进行高分辨率成像。每个条件的多个视野被随机选择以进行成像。收集Z堆栈（0.25 µm），并使用Zeiss Deonvolution软件（Zen Desk V.3.7）进行约束迭代反卷积。使用Fiji ImageJ（V.154F）软件处理图像127。使用具有“最大强度”属性的软件的Z堆叠函数堆叠每个图像。每个图像中的核数在蓝色DAPI通道中手动计数， 丢弃图像中不到80％的区域的细胞。如果细胞在Nuclei128中形成≥5个离散灶，则将它们形成≥5个离散灶或γH2AX阳性，则将视为PRPA阳性。使用GraphPad Prism（V.10.2.0），使用Mann – Whitney检验来统计地比较两种处理之间的阳性核的百分比。 　　使用R（v.4.0.0）软件进行了双面Wilcoxon rank-sum测试，两侧t检验或连续变量的Pearson测试。除非另有规定，否则p <0.05被认为是显着的。 　　WCM IRB对涉及人类参与者的研究进行了审查和批准。患者和参与者提供了书面知情同意，以参加这项研究。从个人获得书面知情同意书，以发布本文中包含的任何可能可识别的图像或数据。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。