人丝氨酸的底物特异性地图集

　　Expi293（Thermo Fisher Scientific）和HEK293T（ATCC）细胞直接从执行短串联重复基因分型的供应商中获得，以对人类细胞进行身份验证，并被证实为无霉菌性。SF9昆虫细胞来自Thermo Fisher Scientific。 　　为了表达和纯化细菌，使用Genesmart预测软件（Genscript），将下面列出的人类Ser/Thr激酶，结合伴侣和伴侣的DNA序列在大肠杆菌中表达进行了优化。优化的编码序列合成为Gblocks（集成的DNA技术），在5'和3'末端携带16 bp悬垂，以促进融合后克隆（Clontech）进入PET表达载体（EMD Millipore）。 　　PCDFDUET1构建体如下：HSP90AA1-HIS6（全长），以下称为“ HSP90”；未标记的HSP90（全长）；His6-MO25A（全长）；HIS6-ALPHAK3/ALPK1 N末端域（1-474）；和His8-CCNC（全长）与Med12-His8（1-100）同时；未标记的MEK5/MAP2K5（S311D，T315D；全长）;和未标记的CK2B（全长）。PET28A结构如下：His6-PDPK1（全长）；HIS6-PRP4/PRPF4B（519 – END）;GST-CAMK1A（全长）;GST-CHAK2/TRPM6（1699 – END）;his6-camlck/mylk3（490 – end）;HIS6-CAMKK1（124-411）;HIS6-ERK7/MAPK15（全长）;HIS6-SUMO-ALPHAK3/ALPK1 CTD（959 – END）;myo3a-his6（1-308）;ERK5/MAPK7-HIS6（1-405）;HIS6-NIK/MAP3K14（327–673）;和BMPR2-HIS6（172-504）。PETDUET1构建体如下：His6-CDK8（1-360，与CDK19的C-Tail（360 – End）），His6-CDK19（全长）；HIS6-AAK1（27-365）;HIS6自行车（37-345）;CK2A1-HIS6（全长）;CK2A2-HIS6（全长）;HIS10-MBP-MEKK1/MAP3K1（1174 – END）;HIS6-CLK1（128-END）；HIS8-PLK2（57–360）;HIS10-MAP3K15（631–922）;HIS6-SUMO-ASK1/MAP3K5（659–951）;和HIS6-TAO2（1-350）。Pacyduet1构建体如下：未标记的CDC37（全长）。 　　For enhanced expression in mammalian lines cells, the DNA sequences of His6-GST-SBK1(full length) and Flag-His6-WNK3(1–434) were optimized for expression in Homo sapiens using GeneSmart (GenScript) and synthesized as gBlocks (Integrated DNA Technologies) carrying 16 bp overhangs to facilitate in-fusion cloning into digested pCDNA3.4 (Thermo费舍尔科学）。 　　为了生成TAK1/MAP3K7的哺乳动物表达构建体，该激酶（GE Healthcare Dharmacon，MHS6278-202756930）的编码序列及其结合伙伴TAB1（GE Healthcare Dharmacon，MHS6278-20278-202760135）（tak1（1–303）-tab1（451 – end））通过融合内进入哺乳动物表达载体。 　　从其他实验室或添加剂购买或获得的表达构建体如下：GST-VRK1（全长）（全长）和GST-VRK2（全长）的细菌表达构建体（PGEX-4T）作为P. lazo62的礼物接收到PGEX-4T中。在PET23A+中，小鼠CDKL5-HIS6（1-352）的细菌表达构建体被作为S. katayama63的礼物接收。His6-Sumo-PDHK1（全长），His6-Sumo-PDHK4（全长），pgroesl（groel/groes）和MBP-BCKDK（全长）的细菌表达构建体作为D. Chuang，S.-C。的礼物接收。TSO和R.Wynn64,65。Pproex HTA-BRAF_16MUT V600E（444–721）是M. therrien ofMontréal66的礼物。D. cortez67提供了FLAG-ATR（S1333A）和HA-ATRIP的哺乳动物表达构建体。DMPK1，CAMK1G，CAMK2G，PHKG2，CDKL1，GAK和LAMBDA磷酸酶的细菌表达构建体购自Addgene（Addgene，1000000094）68。 　　除非另有规定，否则使用BL21星细胞（Thermo Fisher Scientific）进行转换。所使用的抗生素浓度如下：甲求苯霉素（100 mg l -1），卡纳米霉素（50 mg L -1），Spiteinycomin（25 mg L -1）和氯霉素（乙醇中的25 mg L -1），新鲜的新鲜）。通过在37°C下以190 rpm摇动直至光密度（λ= 600 nm）达到0.7-0.8，在1升1升的肉汤中生长了转化的细胞，添加了1 mM IPTG以诱导表达。然后将细胞转移到冷藏振荡器中，并在18°C下以220 rpm摇动16–20小时。将细胞以6,000克离心，并在液氮中捕获液体，并存储在-80°C下。 　　在4°C下进行蛋白质纯化的所有步骤。将细胞颗粒溶解在裂解缓冲液中（如下所述），并通过探针超声处理。将裂解液以20,000克离心1小时，并将上清液与亲和力纯化树脂，NTA NTA（Qiagen）或谷胱甘肽Sepharose（GE Health）相结合，后者被冲洗在碱基缓冲液中。将上清液浆浆搅拌30分钟。用1升基本缓冲液洗涤树脂，并在10床的洗脱缓冲液中洗脱。使用超出离心过滤器单位（Amicon）浓缩洗脱蛋白，补充了1 mM DTT和25％甘油，并在液氮中snap-frozen，并存储在-80°C下。 　　缓冲区如下。标准裂解缓冲液：50 mm Tris pH 8.0、100 mM NaCl，2 mM MGCL2、2％甘油，无EDTA无EDTA磷酸酶和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Life Technologies），5mmβ-汞乙醇和1-3 g的溶菌酶（Sigma-Aldrich）。标准基础缓冲液：50 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl，2 mM MGCL2，2％甘油（包括50 mM咪唑用于涉及多组氨酸标签的净化）。标准洗涤缓冲液：50 mM Tris pH 8.0，500 mm NaCl，2 mM MGCL2，2％甘油（包括50 mM咪唑包括用于涉及多组氨酸标签的纯化）。多组氨酸-TAG洗脱缓冲液：50 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl，2 mM MGCL2，2％甘油，350 mm咪唑。GST-TAG洗脱缓冲液：50 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl，2 mM MGCL2，2％甘油，10 mM谷胱甘肽（在添加谷胱甘肽后调整pH）。 　　CDK8与CCNC/MED12共纯化。CDK19与CCNC/MED12共纯化。CK2A1和CK2A2与CK2B共纯化。ERK5与MEK5DD共表达。激酶BRAF和NIK与未标记的HSP90-CDC37复合物共表达。Alphak3 N-和C末端结构域被共纯化。DMPK1，CAMK1G，CAMK2G，PHKG2，CDKL1和GAK与Rosetta 2细胞（Novagen）中的Lambda磷酸酶共表达。PDHK1, PDHK4 and BCKDK were co-expressed with GroeL/GroeS and purified with the following buffers: lysis buffer (100 mM potassium phosphate pH 7.5, 10 mM -arginine, 500 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 0.2% Triton X-100, lysozyme), wash buffer (50 mM potassium磷酸盐pH 7.5、10毫米精氨酸，500毫米NaCl，0.1％Triton X-100、2 mM MGCL2）和洗脱缓冲液（25 mm Tris pH 7.5，120 mm KCl，0.02％KCl，0.02％Tween-20，50 mm Argininine，350 mm imidazole for PDHK1和PDHK1和PDHK4，20 mm MM MM MM MM MMMMM MMMM MMMMMMM MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM。BCKDK通过其在双链淀粉树脂（NEB）上的MBP标签纯化。CDKL5在BL21-Codonplus（DE3）-RIL细胞中表达。如先前所述，纯化了KIS（全长）69。 　　在100 r.c.f.的磁性搅拌平台上，在500 mL Expi293表达培养基（Thermo Fisher Scientific）中培养了Expi293F细胞（Thermo Fisher Scientific）。在8％CO2以下36.8°C下。为了转染，将500μg的表达构建体稀释在Opti-Mem I降低血清培养基（Thermo Fisher Scientific）中。将外去肌胺293试剂（Thermo Fisher Scientific）分别稀释，然后在室温下与稀释的质粒DNA合并10分钟。然后将混合物转移到细胞中（每毫升3×106个细胞）并搅拌。然后，转染后20小时，将Expifectamine 293转染增强子1和增强子2（Thermo Fisher Scientific）添加到细胞中。两天后，将细胞以300克离心5分钟，在液氮中迅速冻结，并储存在-80°C（转染后3天）。 　　在4°C下进行蛋白质纯化的所有步骤。将细胞颗粒溶解在裂解缓冲液中，并通过Dounce均质化裂解（20杆）。将裂解物以100,000克离心1小时，并将上清液与亲和纯化树脂，镍NTA（Qiagen），谷胱甘肽Sepharose（GE Health）或抗Flag M2亲和力凝胶（Sigma-Aldrich）相结合，并搅拌30分钟（nickel and Glutathione Beads）或1 Heards beands beands beats bealts beants beants beats beats beant（1 H）。用1升基本缓冲液洗涤树脂，并在10床的洗脱缓冲液中洗脱。为了洗脱标记的标记蛋白，将珠浸入洗脱缓冲液（0.15μgml-1 3×FLAG肽（Sigma-Aldrich））中，在洗脱前搅拌1小时。使用超出离心过滤器单位（Amicon）浓缩洗脱蛋白，补充了1 mM DTT和25％甘油，并在液氮中snap-frozen并储存在-80°C下。 　　缓冲区如下。标准裂解缓冲液：50 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl，2 mM MGCL2，5％甘油，1％Triton X-100，5 mMβ-苯甲醇，停止的蛋白酶抑制剂。标准基础缓冲液：50 mm Tris pH 8.0，100 mm NaCl，2 mM MGCL2，2％甘油。标准洗涤缓冲液：50 mm Tris pH 8.0，500 mm NaCl，2 mM MGCL2，2％甘油。 　　在镍和谷胱甘肽树脂上顺序纯化了His6-GST标记的SBK。缓冲区如下：第一个洗涤缓冲液：25毫米咪唑。多组氨酸标签的SBK1洗脱缓冲液：50 mm Tris pH 8.0，100 mm NaCl，2 mM MGCL2，2％甘油，250 mm咪唑。GST标签的SBK1洗脱缓冲液：50 mm Tris pH 8.0，100 mm NaCl，2 mm MGCL2，2％甘油，10 mm谷胱甘肽。FLAG – TAK1 – TAB1洗脱缓冲液：50 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl，2 mM MGCL2，2％甘油，0.15μgml -1 3×FLAG肽。 　　将FLAG-HIS6 – WNK3顺序纯化在镍上，然后在抗flag树脂上纯化。缓冲区如下：第一个洗涤缓冲液：25毫米咪唑。标志标签洗脱缓冲液（不含氯）：50 mM Tris pH 7.5，2 mm乙酸镁，2％甘油，0.15μgml-1 3×FLAG肽。 　　FLAG-ATR（S1333A）（350μL）和HA-ATRIP（150μg）共转染到EXPI293细胞中，并在添加增强剂后（转染后4天）再孵育一天。缓冲区如下。ATR裂解缓冲液：50 mM HEPES pH 7.4、150 mm NaCl，10％甘油，0.25％Tween-20，2 mm MGCL2，DTT。ATR洗涤缓冲液：50 mm HEPES pH 7.4、150 mm NaCl，0.01％Brij-35、2 mM MGCl2、5 mm ATP，DTT。ATR洗脱缓冲液：20 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl，0.01％Brij-35，DTT，0.15μgml-1 3×FLAG肽。 　　在100 kDa MWCO Amicon管中浓缩了1毫升，并使用MONOS柱在0-1 M NaCl梯度（缓冲液：25 mM BIS-Tris pH 6.9，0.01％Brij-35和5 mM TCEP）中解决。总共收集了总共1 mL。将1–4组合组合并使用100 kDa MWCO滤光片组合到1 mL，并在20 mM HEPES pH 7.4、200 mM NaCl，0.01％Brij-35和5 mM TCEP中使用尺寸 - 排斥（Superose 6）解决。总共收集了总共1 mL。分数11–14在SDS页面上被证实为纯ATR -ATRIP复合物。 　　如前所述，从HEK293T细胞中纯化了SMG1 -SMG9复合物70。如先前所述，从昆虫细胞中纯化了RIPK1，RIPK2和RIPK3。从其他实验室获得的以下重组活性激酶。重组活性CDK12 -CYCK，CDK13 – CYCK和CDK9 – CYCT复合物作为M. Geyer72,73的礼物提供。重组活跃的DCAMKL1/DCLK1和MELK作为N. Gray，H.-T。的礼物。Huang和K. Westover，Y. Liu和W. Harshburger74,75,76。重组活性PRPK（全长）–CGI121/TPRKB（全长）复合物是作为L. Wan和F. Sicheri77的礼物提供的。重组活跃的haspin（452-798）是A. Musacchio78的礼物。重组活跃的YSK1作为X. luo79的礼物提供。重组CK1G2作为S. Knapp的礼物提供。补充表1提供了目录和批量购买的重组激酶的清单。 　　将重组激酶添加到一个384孔板中，该板在50μm（ANASPEC，AS-62017-1和AS-62335）的溶液相中含有肽底物库混合物。通过添加50μMATP（50μCIML-1γ-32P-ATP，Perkin-Elmer）启动反应，并孵育90分钟。补充表1中描述了每种激酶的测定条件（参考文献80,81,82,83,84）。反应完成后，将溶液发现在链霉亲和素偶联的膜上（Promega，v2861），其中肽通过其C末端生物素化紧密相关。将膜冲洗，然后使用台风FLA 7000磷酸胶质器（GE）进行成像，以测量肽磷酸化的程度。使用ImageQuant（GE）对原始数据（凝胶文件）进行定量以生成光密度矩阵（补充表2）。对于激酶Alphak3，由于背景信号的空间变化，将斑点标准化到周围背景。PDHK1和PDHK4显示丝氨酸和酪氨酸的双重特异性。对于这些激酶，我们使用了在随机位置没有酪氨酸残基的定制肽底物库。 　　总共有283个人类激酶基序，一个来自小鼠激酶直系同源物（CDKL5）的基序，一个来自大鼠激酶直系同源物（KIS）的基序，一个来自Arthropod Pediculus humanus Corporis Corporis Onthologue（pink1）的基序，与17个人类Kinase Otifs结合使用，包括我们以前出版的17个人类Kinase Motifs。SRPK235，SRPK335，CK1D35，DYRK1A86，DYRK286，GSK3A86，GSK3B86，CK1A86，CK1E86，CK1G1E86，CK1G186，CK1G186，CDK1087，CDK288，CDK288，CDKK288，CDKK1188888888889。 　　对于扩展数据中的零控制实验，将生物素基化的肽合成仅包含丝氨酸或苏氨酸作为磷酸化型受体，其中所有九个周围位置均包含20种天然氨基酸的变性混合物，这些氨基酸包括丝氨酸，噻吩氨酸，酪氨酸，酪氨酸和细胞蛋白。 　　通过17个随机氨基酸（不包括丝氨酸，苏氨酸和半胱氨酸）的总和在所有位置都将光密度矩阵在所有位置均衡，以产生PSSM（补充表2）。将PDHK1和PDHK4标准化为16个随机氨基酸（不包括丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸和另外酪氨酸），对应于独特定制的肽库，该肽库分析了这些激酶。半胱氨酸行的中位数比例为1/17（PDHK1和PDHK4为1/16）。每个位置中的丝氨酸和苏氨酸值都设置为该位置的中位数。The ratio of serine versus threonine phospho-acceptor favourability (S0 and T0, respectively) was determined by summing the values of the serine and threonine rows in the densitometry matrix (SS and ST, respectively), accounting for the different serine versus threonine composition of the central (1:1) and peripheral (only serine or only threonine) positions (Sctrl andTCTRL分别），然后分别将两个（S0和T0的补充注释1）之间归一化为较高的值。 　　图2中的树状图是使用具有20个未修饰氨基酸的归一化基质以及磷酸酪氨酸和磷酸酪氨酸生成的。使用病房方法使用Python（v.3.7.6）中的Scipy软件包计算链接矩阵。结果被转换为纽瓦克树的格式，并使用Figtree（V.1.4.4）绘制。 　　对于评分底物，将相应位置中相应氨基酸的值乘以并缩放为随机肽的概率（补充注释2）。 　　对于给定激酶的底物的百分位评分，我们首先使用上述方法来计算该激酶PSSM的先验评分分布，该方法包括82,735个识别位点4（图3A）。激酶 - 基底对的百分位分数定义为在每个Kinase34的得分分布中底物的百分位排名。分析所有检测到的激酶富集磷酸化位点时使用了该值。 　　在分析的磷酸化蛋白质组学研究中，单个磷酸化位点（不包括多磷酸化的肽）均由所有特征性激酶（303 Ser/thr激酶）进行评分，并在已知的磷酸蛋白酶分布中的等级确定，如上所述确定。对于每个非塑料，单一磷酸化的位点，在Ser/Thr激酶的前15个激酶中排名在该磷酸化位点的生化激酶。为了评估磷酸化蛋白质学数据集中的激酶基序富集，我们比较了在上调/下调/下调/下调（分别增加/减少的磷酸化位点）中每种激酶的磷酸化位点的百分比在本研究中的不受管制（不变）位点的集合中的激酶（具有| log2 [fold Change] |小于log [fold Change change]阈值的位点）。除图4E外，对数转换的折叠变化阈值被确定为所有面板的1.5，因为图4E，由于数据中的log [fold更改]，该阈值设置为0.5。使用Haldane校正校正应变表（将其中一个计数中的零零添加0.5）。使用单侧Fisher的精确测试确定统计显着性，并使用Benjamini-Hochberg程序调整相应的P值。在下游分析中排除了明显富集（调整后的P≤0.1）的激酶（调整后的P≤0.1）或耗尽的（log2 [频率因子] <0）。然后，对于每个激酶，根据调整后的P值选择了最显着的富集侧（上调或下调），并在火山图中呈现。 　　使用Python90中的徽标包装制作序列徽标。对于单个激酶，使用了归一化矩阵，其中每个字母的高度是其值与该位置的中位数的比率。将中心位置（零位置）处的丝氨酸和苏氨酸高度设置为其可爱性之间的比率。对于聚集的激酶，如上所述计算平均基质并作为序列徽标表示。 　　对于扩展数据图7，激酶通过其log2 [S0/T0]值分类。对于序列徽标，从先前对齐的激酶序列91获得了290个可用激酶的激酶结构域。对于每种激酶，获得了CDK2（蛋白质数据库（PDB）：1QMZ）中Met1 – Leu296的比对，并计算了15-激酶的增量氨基酸的频率，并绘制为序列徽标。 　　实验验证的激酶 - 基底关系是从Phosphoseingplus获得的（2021年7月）。每对的报告数量由体内和体外报告的总和确定。 　　使用Biorender（https://biorender.com/）生成实验模型和说明性模型。使用珊瑚（http://phanstiel-lab.med.unc.unc.edu/coral/）生成并修改了Kinome树图像。使用Pymol生成结构插图。图1和图2中的通用激酶结构域。1和3如下：PKAα（PDB：1ATP）。图3中的激酶和底物结构如下：ATM（PDB：7SIC）92和P53（Alphafold AF-P04637-F1-MODEL_V2_1（1-95）61和2ATA（96–292）92（96–292）92）（图3C）和phk2（Pyb：2yb：pyg：2yj J. 2yj J.2yj）1ABB）92（图3b）。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。