DNA聚合酶γ的祖先等位基因修饰抗病毒耐受性

　　根据《赫尔辛基宣言》，收集人类样本并根据知情同意使用，并得到了库皮奥大学中央医院（410/2019）伦理审查委员会的批准。动物实验程序得到芬兰动物实验委员会的批准（ESAVI/689/4.10.07/2015和ESAVI/3686/2021）。患者和对照材料包括成纤维细胞（由个体前臂的皮肤活检确定），血液和尸检衍生的脑样本。对照样本来自自愿健康个体（成纤维细胞和血清），对于大脑，来自那些因非中心损害 - 系统疾病疾病而急性死亡的人。尸检样本收集已获得政府社会主题和健康办公室的批准。 　　补充表6提供了抗体和寡核苷酸序列的信息。酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，用于所有亚型IFNα（42115-1）（42115-1），小鼠IFNβ，IFNβ（42410-1），小鼠IL-6，小鼠IL-6（BMS603HS），人类IL-6（BMS603HS），人类IL-6（BMS）（BMS）（BMS）（BMS）（BMS）（BMS）（BMS）（BMS）（BMS）（BMS）（bms）（bmss）（bmms iil-211）（HSTA00E）和CellTiter-Glo发光细胞活力测定套件（Promega）商业购买，并根据制造商的说明进行了测定。 　　产生MIRAS敲击小鼠并保持在C57BL/6jolahsd背景中，该背景携带了两个与MiRAS突变同源于小鼠染色体上的突变（NCBI参考序列：NC_00000073.7）的变体：C.2177G> c c.2177G> C进入Exon 13（P.W726S）；c.3362a> g进入外显子21（P.E1121G）。简而言之，通过引入内源基因的电穿孔和同源重组，将带有MIRAS变体的POLG1基因组区域4–22的PL253构建体转染到了胚胎（ES）细胞中。基于新霉素的耐药性选择了具有成功重组的ES克隆。使用Southern印迹杂交，PCR和DNA测序（DNA-SEQ）确认突变。将正确的ES克隆注入胚泡中，并植入伪孕的雌性小鼠中。用表达FLP重组酶的小鼠越过具有经过验证的种系传输的线，以去除新霉素盒。通过DNA-Seq证实了MIRAS小鼠的正确基因型。基因型出生于门德尔频率，两组之间没有表型的粗糙差异。在12 h – 12 h的光线周期内将小鼠在22°C的受控房间内容纳，并随意进入食物和水，并定期监测体重和食物的消耗。进一步的详细信息在扩展数据中提供了图6。 　　人类原发性皮肤成纤维细胞（前8个通过；±2个不同个体的细胞系之间的±2段差异）用于遗传筛选用于MIRAS点突变（通过DNA-SEQ）进行分析。在DMEM（Lonza; 4.5 g L-1葡萄糖）中培养成纤维细胞，并补充了10％（v/v）热灭活的FBS（LONZA），50 U ML-1 Penicillin-链霉菌素（Gibco），0.05 mg ML-1尿液（0.05 mg ml-1尿液（Calbiochem）和2 mmax（calbiochem）和2 mm glomax（Gib）（Gib）（gib）（glutam）（gm glomax（Gib）（Gib）（gmmax）（gm glutam）（gm glutam cco）（二氧化碳，每2天更换新鲜培养基，并对支原体进行阴性测试。使用Fugene HD转染试剂（Promega）进行合成DSDNA50和DSRNA（Poly（I：C），Sigma-Aldrich）的转染。简而言之，转染前一天将约2×105的细胞铺在六孔菜肴上，并用2.5μg的dsDNA或dsRNA转染，核酸的1：2比例：根据制造商的指令，转染试剂比例为1：2（补充表6中提供了序列详细信息）。为了表达RIG-I或MAV，将成纤维细胞用PCDNA3.1（+） - 含有RIG-I（N）或MAVS51的FLAG转染，然后在24小时后转染（I：C）转染之前，并在收集前再孵育7 h。 　　对于MiRAS POLG1遗传校正，如先前所述52进行了用CRISPR – CAS9系统组件进行电穿孔。我们使用了高效率GRNA和DSDNA供体模板，包括所需的校正以及Sali（GˆTCGAC）的新型限制位置。通过sali消化单独筛选了总共55个单克隆菌落，并通过Sanger测序验证了成功的校正。染色体完整性通过AnàlisisMèdiquesBarcelona进行的G带证实。补充表6中提供了GRNA，供体模板和引物（CRISPOR，https：//benchling.com）的顶级六角式Sanger测序的列表。 　　Induced pluripotent stem cells (iPSCs) were cultured on Matrigel-coated (Corning) plates in E8 medium (Thermo Fisher Scientific) until 90–100% confluency, then split and plated in suspension in ultra-low attachment plates containing hES medium without basic fibroblast growth factor (bFGF) and supplemented with 5 µM ROCK inhibitor (Y-27632, Selleckchem).每隔一天直到第14天，将没有岩石抑制剂的培养基刷新，当时将聚集体铺在含有DMEM/F12+20％FBS（Thermo Fisher Scientific）的明胶涂层板上，以进行膨胀。将细胞保持至少5个传递，以获得诱导的成纤维细胞样细胞（IFLCS）。 　　根据制造商的说明，使用RNeasy试剂盒（Qiagen）提取细胞中的RNA。对于组织，首先使用陶瓷珠使用先例24均匀蛋白（先例）在RNA提取前使用Trizol/氯仿法进行均质化，然后使用RNeasy套件进行纯化。使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific）在QPCR之前，使用simfast sybr no-rox试剂盒（bioline）（bioline）和引物（补充表6中的详细信息），根据制造商的说明，使用了DNase处理的RNA（跨样品归一化）进行cDNA合成。测定基因的扩增水平（每个对照和患者的2-4个技术复制）被标准化以使用该方法进行ACTB和分析。如上所述，使用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen）和以前的DNA进行MTDNA qPCR进行了DNA进行，并将其标准化为核ACTB或B2M。对于病毒RNA分析，使用Taqman Fast Virus 1-Step Master Mix（Thermo Fisher Scientific）根据制造商的指示，使用引物和针对靶向病毒基因组的TAQMAN探针检测到TBEV NS5 RNA54或鼠肝炎病毒55 RNA量。TBEV NS5 RNA的拷贝数是使用由TBEV溶解的NS5 RNA的连续稀释产生的标准曲线确定的。补充表6中提供了引物的详细信息。 　　将沉淀的细胞重悬于分离缓冲液中（20 mM Hepes-KOH pH 7.6，220 mm甘露醇，70 mM蔗糖，1 mM EDTA，1毫米EDTA，1倍蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientific），并分为两个相等的分数：分数1，净化总细胞RNA或DNA；和分数2，亚细胞分级分离胞质RNA或DNA。简而言之，将分数2在带有玻璃杵（〜15笔冲程）的手持式悬浮液中均匀的悬浮缓冲液中匀浆。将匀浆在4°C下以800 g离心5分钟，并在4°C下以12,000 g离心10分钟。收集上清液并在4°C下以17,000 g离心15分钟，以纯化胞质分数。使用RNeasy试剂盒或DNAeasy血液和组织试剂盒（Qiagen）对整个细胞（分数1）和胞质（分数2的分数）进行DNA或RNA纯化，并将其洗脱成相等的水。在产生cDNA之前，用DNase处理RNA洗脱。使用核基因引物（ACTB或B2M）或线粒体基因组特异性引物（MT-CYB和MT-CO1），使用等体积的cDNA或DNA洗脱素。整个细胞中的mtDNA/RNA丰度作为归一化对照，以从胞质分数获得的值18。通过蛋白质印迹检查了胞质分数的纯度。 　　注射后24小时，对接受每克小鼠重量的300μgBRDU（BD生物溶质）进行腹膜内注射的小鼠被安乐死。通过常规的苯酚 - 氯仿提取分离DNA。如前所述53，使用琼脂糖凝胶电泳分离XHOI消化的DNA，并将其印迹到Hybond N+膜（Amersham）上。53。使用抗BRDU抗体进行免疫检测，并使用南部杂交检测到总mtDNA，如前所述56。 　　TBEV的欧洲亚型从人类神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH；通道1）中分离出，这些细胞被芬兰收集的tick感染了57；SARS-COV-2从人类非小细胞肺癌（CALU-1）细胞中的CoVID-19患者中分离出来，该细胞通过慢病毒Transduction 59;在Vero细胞上传递了单纯疱疹病毒1，HSV-160的KOS菌株。SK-N-SH（https://www.atcc.org/products/htb-11），calu-1（https://wwwww.atcc.org/products/htb-54），vero E6（https：//wwwwwww.atcc.org/productucts/productucts/crl-1586）（https://www.atcc.org/products/ccl-81）从ATCC购买了细胞。病毒工作是在TBEV和SARS-COV-2的生物安全3（BSL-3）条件下以及HSV-1的BSL-2条件下进行的。通过将在96孔板上生长的细胞具有连续十倍稀释的病毒储备，测试了病毒感染成纤维细胞的能力，并根据稀释的稀释度，显示了使用免疫荧光的野生型对照和miRAS细胞之间感染细胞数量最突出的差异。 　　对于成纤维细胞感染，在前一天（或〜1×105 IFLC 2天前2天）在六孔板上生长了约2×105个成纤维细胞，被500 µL的1:20稀释的TBEV接种，1:10稀释的SARS-COV-2或1：5,000稀释的HSV-1稀释的HSV-1（Moi）（moi）1小时（在37°C，5％CO2）后，去除接种物，将细胞用条件培养基洗涤两次，将3 mL的新鲜培养基添加到每个孔中，并将板在5％CO2下在5％CO2下孵育6、24或48 h。与受病毒感染的那些同时铺板的未处理细胞被用作未感染的对照。在孵育结束时，将细胞用PBS洗涤两次，并在RIPA缓冲液中裂解（50 mM Tris，150 mM NaCl，1％Triton X-100，0.1％SDS，0.5％脱氧氯酸钠，pH 8.0，pH 8.0，pH 8.0），补充了EDTA无蛋白酶抑制剂cocktail（roche），并在150 pylys provent provent provent provent provent provent。对于DNA/RNA分析，如相关方法部分所述，将60 µL的RIPA裂解物与DNA或RNA提取之前的Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific）以及RT -QPCR或QPCR混合。对于免疫荧光测定，用4％多聚甲醛（PFA，PBS）固定感染的细胞，并在室温下孵育15分钟。将细胞用PBS洗涤一次，在室温下用Tris缓冲盐水透化5分钟，pH 7.4补充了0.25％Triton X-100，牛血清白蛋白的3％（w/v），并替换为PBS。通过用500 mJ cm-2剂量灭活病毒，在与原代抗体孵育之前，通过紫外线灭活，并如下所述进行处理。 　　将PFA固定的病毒感染细胞用原代抗体（补充表6）在4°C下过夜，并在室温下用继发性抗体染色1小时。每个步骤之间包括三个用PBS洗涤。盖玻片用含有DAPI（矢量实验室）的Vectashield抗弹性安装介质安装。使用Zeiss AxioImager表层显微镜获取图像。使用Cell -Profiler（V.4.2.6）61进行免疫荧光信号的定量。 　　在RIPA缓冲液中裂解的细胞（150 mM NaCl，1％Triton X-100，0.5％脱氧乙酸钠，0.1％SDS，50 mM Tris-Cl，pH 8.0）用于使用BCA分析（Pierce）（Piere）和蛋白质样本相等的蛋白质浓度，并溶于SDS – 50 MMMM（PIERCE）（PIERCE）均为50 mm（50 mm）。Dithiothreitol，2％（w/v）十二烷基硫酸钠，10％（w/v）甘油，0.1％（w/v）Bromophenol Blue），在SDS-PAGE分析之前，使用4-20％梯度凝胶（Bio-Rad）在SDS-PAGE分析前在95°C煮沸5-10分钟，根据制造商的指示。 　　对于线粒体蛋白分析，如先前所述，使用差分离心从组织中分离线粒体62。将澄清的线粒体颗粒恢复到缓冲液中（20 mM Hepes-KOH PH 7.6、220 mm甘露醇，70 mM蔗糖，1 mM EDTA），并使用SDS-PAGE分析，或使用1％（W/V）N-Dodecyl-β-Maltroi​​c（dododecyl-β-氨基酸含量）溶解或溶解液（dddodecyl-maltron-min）。在冰上进行蓝色（BN）电泳分析。将DDM溶解的样品在4°C下以20,000克离心20分钟。使用BCA测定法测量了澄清的上清液，并使用BN载荷染料（0.25％（w/v）Coomassie蓝色G250（MP BioMedicals），75 mMα-氨基N-辅助酸75 mmα-氨基酸），使用caterode phis phis-nis phis-bis-bsim phis（75mmα-氨基酸），将等量等量的蛋白质样品与BN加载染料（0.25％（w/v）Coomassie Blue G250（MP BioMedicals）混合。自铸造的1毫米厚度为5–12％的梯度聚丙烯酰胺凝胶，0.02％（w/v）Coomassie Blue G250）和阳极缓冲液（50 mm Bis-Tris，pH 7.0）。通过混合5和12％丙烯酰胺的溶液（丙烯酰胺：双烯酰胺37.5：1）在0.5mα-氨基N-二核酸，50 mM Bis-Tris（pH 7.0），11或20％（w/v）甘油，0.027％氨基含量为0.1％的0.027％（ph 7.0），含量为0.5mα-氨基N-磷液中，制备了凝胶的分离部分。如上所述，将分离凝胶用4％丙烯酰胺堆叠凝胶溶液叠加（无甘油；但0.084％过硫酸铵，0.17％Temed）。 　　电泳后，使用半传递（SDS-PAGE）或湿转移（BN-PAGE）设备（Bio-Rad）将凝胶转移到0.45μMPVDF膜上，然后使用所需的抗体（补充表6中提供了详细信息）。使用Chemidoc XRS+成像机（Bio-Rad）获得图像，并根据制造商的说明使用Image Lab（V.6.1.0构建7; Bio-Rad）对信号进行定量。将蛋白质信号归一化为样品中的负载控制信号。 　　如先前所述，使用了6m跑步机（哥伦布仪器）63。测试是在1小时内完成的五项独立试验的一组。当鼠标连续停止五秒钟而没有继续进行时，计算了运行时间。 　　如前所述64，使用了带有PVC鼓（直径为44毫米）的旋转杆系统（Rota-Rod; Ugo Basile，47600）。在测试前连续三天对动物进行训练。 　　鼠标脚上用无毒的洗涤涂料（用于后肢和前肢的单独颜色）涂漆，并允许鼠标​​穿过纸上的隧道。测量步幅的长度和宽度。使用每只脚至少连续两个步骤获得评分数据。 　　将小鼠运输到BSL-3设施中，并适应单独通风的生物内膜笼子（Isocage; Scanbur）7天，然后用1,000个TBEV的斑块形成单位进行接种腹膜内。使用商业购买的ELISA试剂盒收集感染后的指示几天，并收集血清进行细胞因子分析（请参阅“抗体，抗血清和试剂盒”部分）。对于DNA，RNA或蛋白质分析（请参见相关方法部分），将组织收集到TRIZOL试剂（Thermo Fisher Scientific）中。对于组织学，将肝样品固定在PBS中的冷4％（v/v）PFA中，并在PBS中在4°C的PBS中孵育3天3天，然后在OCT化合物中进行例行嵌入4°C，并以6-8μm的厚度为6-8μmmatoxoxysof Haeematoxys and Oro和eosin Oro和eoo Oro sansing6-8μm。对于免疫组织化学染色，用以下抗体染色：CD3（T细胞标记），CD4（Helper T细胞标记），CD8B（细胞毒性T细胞标记）或CD68（巨噬细胞标记物）使用IMMPRESS HRP GOAT抗RAT抗RAT抗RAT-RATI-RATAT IGG（MORPOCH MARKER）444.MORTARIES MORTARIES MORTARIES（MORTARITAR）（VARISE）（MOR）（VARISE）。并根据制造商的说明进行血久毒素抗染色。肝脏炎症严重程度是半定量评分的，并以×5放大倍率（每看视图15,370,559μm2）从三个独特的视野中量化免疫细胞浸润的总数。使用ImageJ（2.0.0.0-rc-69/1.52n; https：//imagej.net/ij/）测量最大浸润的面积（μm2）。使用Ilastik（v.1.3.3）66在像素分类后使用细胞生理器（V.4.2.6）61对肝ORO和CD蛋白信号进行定量。 　　对于脑组织学，将脑半半（切成中线切割）固定在PFA中48小时，然后储存在70％（v/v）的酒精中直至加工。它们被修剪并常规地嵌入了石蜡。制备连续切片（3-4 µM）并用血木毒素和曙红染色，或对TBEV抗原，CD3（T细胞标记），CD45R/B220（B细胞标记）（B细胞标记）和IBA1进行免疫组织化学染色（巨噬细胞和微胶质细胞的标记），以前是以前出现的。小鼠脑GABA能标记物染色是使用A.P.（神经病理学家）的GAD67和GABRB2抗体进行了盲目的半定量评分。补充表6中提供了抗体的细节。 　　如前所述69,70，根据Drop-Seq方案在BioMedicum功能基因组学单元（赫尔辛基大学）上进行RNA-Seq。总共将10 ng提取的RNA用作起始材料。使用Tapestation DNA高灵敏度测定（Agilent）评估测序文库的质量。在Illumina NextSeq 500 System70上对库进行了测序。为了读取数字表达数据的对齐和生成，使用FASTQC和MultiQC71,72检查了原始测序数据。随后，使用Trimmomatic73过滤读取以去除低质量读数并短于20 bp。然后根据所述管道（v.2.3.0），使用滴序工具进一步处理传递过滤器的读数。简而言之，使用PICARD工具（http://broadinstitute.github.io/picard）将原始的，过滤的读取库被转换为排序的BAM文件。接下来是带有样品特异性条形码和唯一分子标识符（UMIS）的标签读数。然后将标记的读​​数用于5'适配器和3'poly A尾巴。对齐准备读取的读数已从BAM形式的文件转换为FASTQ文件，这些文件被用作Star Aligner74的输入。使用GRCM38（鼠标）参考基因组和Gencode鼠标发行28或GRCH38（人）参考基因组和Gencode人类版本33综合基因注释文件75进行比对进行比对。对齐后，对唯一的对齐读数进行了分类并与以前的未对齐标记的BAM文件合并，以重新恢复在对齐步骤中丢失的条形码和UMIS。接下来，将注释标签添加到对齐和条形码标签的BAM文件中以完成对齐过程。最后，使用Drop-seq工具来检测和纠正样品条形码序列中存在的系统合成误差。然后通过计算唯一UMI序列的总数来创建数字表达矩阵 （仅将单个碱基不同的UMI序列合并在一起）。在R环境中使用DESEQ2（使用默认设置）进行差异表达分析76。 　　从热乙醇中的20 mg小鼠脑皮质中提取代谢产物。简而言之，使用先例24均匀剂（先例）将冷冻样品与0.5 mL 70％（v/v）乙醇一起使用。均质化之前和之后，将样品冷冻（≤ -20°C）。使用0.5 mL的70％（v/v）乙醇将样品转移到15毫升管中。在每个管中，我们添加了70％的70％（v/v）乙醇，该乙醇在75°C下预热，立即涡旋并在75°C下将样品放入水浴中1分钟，然后一次涡旋。将含量在-20°C的冷浴中冷却，然后再离心10分钟（4°C）。将透明的上清液转移到新的试管中，并存储在-80°C下，直到使用质谱法（MS）分析。 　　使用负电离，4 GHz的高分辨率获取和MS1模式下的M/z 50和M/z 1,000的MS1模式以1.4 hz时的MS1模式在1.4 Hz的1.4 Hz时，使用流量注射分析进行了未靶向的代谢物分析，使用负电离，4 GHz高分辨率获取和扫描。溶剂为60:40异丙醇：在pH 9.0时补充了1 mm NH4F的水，以及10 nm Hexakis（1H，1H，1H，3H-二氟丙二氟上丙基）磷酸）和80 nm taurochloric caribibration。依次分析了七个批次。在每个批次中，注射序列是随机的。数据以剖面模式获取，使用MATLAB（MATHWORKS）进行了centro和centros。原始数据中的递归填充了缺失值。在所有样品中鉴定出共有的质心后，通过准确的质量和同位素模式对离子进行了推定的注释。从HMDB V.4.0数据库开始，我们生成了预期离子列表，包括在这些条件下发现的去质子化，氟化和所有主要加合物。列举了与0.001 DA的质量公差内测得的质量相匹配的所有公式。由于该方法不使用色谱分离或深入的MS2表征，因此无法区分具有相同分子式的化合物。注释的信心反映了4级，但实际上，在原代代谢的中间体的情况下，它是更高的，因为它们是细胞中最丰富的代谢物。所得数据矩阵包括1,943个离子，这些离子可以与HMDB v.3.0中列出的去质子化代谢产物匹配。 　　根据制造商的说明，使用TRIZOL试剂（Thermo Fisher Scientific）从50 mg冷冻脑尸检样品中提取蛋白质。将提取的蛋白质颗粒重悬于100μl的缓冲液中，其中含有6 M尿素，50 mM碳酸氢铵，pH 8，并在95°C下煮沸5-10分钟。使用BCA测定法（Pierce）估算蛋白质浓度，并在胺珠77上聚集了相等量的蛋白质样品。对于珠子消化，将50毫米碳酸氢铵缓冲液添加到珠子中。用10 mM DTT在37°C下用10 mM DTT还原30分钟，并在室温下用20 mM IAA烷基化30分钟，然后在黑暗中加入0.5 µg胰蛋白酶，并在37°C下过夜进行过夜。使用磁体分离珠子，将上清液转移到新管中并进行酸化，并使用C18 Stagetips脱盐，用于MS分析。液相色谱与串联MS（LC – MS/MS）对所得肽进行了分析，使用易于NLC1000液体色谱系统（Thermo Electron）与QExactive HF HF混合Quadrupole-Bibitole-Bitibole-Bibitrap质量光谱仪（Thermo Electron（Thermo Electron）耦合，并使用nanoelelectRosprayspraysprayion（reas souse）（sease Electray）（shoto Elector）（热电子）。使用EasySpray C18分析柱（粒径为2 µm，100Å，内径75μm，长度为25 cm； Thermo Fisher Scientific）进行肽的LC分离。将肽在90分钟的梯度中分离为从2％到30％（v/v）乙腈中的0.1％（v/v）甲酸，然后在0.1％（v/v）中使用90％（v/v）乙腈在20分钟内用90％（v/v）乙腈洗涤柱（流量0.3μlmin -1）。所有LC – MS/MS分析均以数据依赖性模式进行，其中最激烈的肽是通过高能量碰撞诱导的分离来自动选择的。为了进行数据分析，将LC -MS/MS分析的原始文件提交给Maxquant（v.1.6.7.0）78用于肽/蛋白质鉴定和无标记定量。参数如下：将氨基甲甲基（C）设置为固定修饰；蛋白质N-乙酰化和蛋氨酸氧化作为可变修饰；20 ppm的第一个搜索错误窗口和6 ppm的主搜索错误；使用了无脯氨酸限制酶选项的胰蛋白酶，并进行了两次误解。将最小的独特肽设置为一个；对于肽和蛋白质鉴定，允许的FDR为0.01（1％）。Uniprot人类数据库（2018年9月）用于数据库搜索。将最大输出文件（proteingroups.txt）加载到Perseus（v.1.6.1.3）79中，以进行进一步的数据过滤和统计分析。去除潜在污染物和反向序列的识别，并将归一化强度（LFQ）变换为归一化。接下来，使用至少一组中至少有50％有效值的标准用于过滤结果。使用每个样品的正态分布的噪声值替换所有零强度值。使用p <0.05的两样本学生的t检验比较蛋白质的丰度，作为两组之间统计学上显着差异的标准。 　　Qiagen Ingenuity途径分析（Qiagen; https://digitalinsights.qiagen.com/ipa），G：Profiler80（https：//biit.cs.ut.eee/gprofiler）工具集和KEGG database81用于分析转录组的分析，用于转录组合体和proteme cotemome，cabolome和proteome，或proteome和proteome和proteome。对于免疫途径分析，我们进一步使用了手动策划的IntedB数据库82（https://www.innatedb.com/index.jsp）。 　　对Finngen研究的数据进行了分析，Finngen研究是一项大规模的基因组学计划，该计划分析了Finnish Biobasts样本，并将遗传变异与健康数据相关联，以了解疾病机制和倾向6。混合模型逻辑回归方法SAIGE（使用RCPP开发的大型数据集和生物库中的RCPP包装用于全基因组关联测试）进行关联分析，并在模型中包括以下协变量：性别，年龄，基因分类批次和十个原理成分。这些结果来自数据冻结7（https://r7.finngen.fi/）的3,095个终点，16,962,023个变体和309,154个人。 　　如图传说中所述的统计分析是使用Macos（GraphPad，www.graphpad.com）的Microsoft Excel v.16.80，GraphPad Prism v.10.1.1进行的，或使用相应图图中指示的工具集和相关方法部分。如上所述，GraphPad Prism v.10.1.1用于使用标准五个数字摘要来创建框和晶须图：最小，下四分位数（25％），中位数（50个百分位数），上四分位数（75个百分位数）和最大值（75个百分位数），并且晶须延伸至最小值至最大值；条形图显示了平均值±S.E.M.每个值的数据点叠加在图上。没有使用统计方法来预先确定样本量。选择样本量以确保足够的力量并考虑潜在的个体/动物，性别和年龄差异（使用年龄和性别匹配样本作为对照）。在各个图中描述了生物独立的小鼠或人类样品的数量。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。