内脏感觉的脑干图

　　所有动物程序遵循《 NIH指南的实验动物护理和使用指南》中概述的道德准则，所有方案均由哈佛医学院的机构动物护理和使用委员会批准。在恒定温度（23±1°C）和相对湿度（46±5％）中保持动物，并保持12小时的光线周期。这项研究中使用的小鼠来自性别和混合遗传背景。GLP1R-IRES-CRE（029283），GPR65-IRES-CRE（029282）和CRHR2-IRES-CRE（033728）小鼠以前在实验室中制造，现在可以在杰克逊实验室使用。Slc17a6-ires-cre (Vglut2-ires-cre, 028863), Slc32a1-ires-cre (Vgat-ires-cre, 028862), Rosa26-lsl-Gfp-L10a (024750), Tac1-ires-cre (021877), Pdyn-ires-cre (027958),Penk-Ires-Cre（025112），Cartpt-IRES-CRE（028533），SST-IRES-CRE（013044），TH-CRE（021877）和GCG-CRE（030542）小鼠是从杰克逊实验室购买的。 　　为了构建用于神经元表达的AAV核能表达JRGECO1A（AAV1-SYN-H2B-JRGECO1A），从PAAV-SYN-NES-JRGECO1A克隆编码JRGECO1A的序列替换编码GCAMP6F的序列。简而言之，Jgreco1a基因通过PCR扩增（正向底漆：ataataggatcccagtcgcccaccaccatgggtggttcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatgggtagg; reververs primerer; reverse primer：reverse primer：ataataaagcttctcgagtggatcatcatctgcagaattctctcgcgcgaactagtgatgatgatcggtcacttcgctgctgtcatcattcattcattgtacaaactc）。切割Jgreco1 PCR产品和PAAV-SYN-H2B-GCAMP6F（BAMHI和HINDIII）并连接在一起。将所得的质粒测序进行验证，并由波士顿儿童医院病毒核心设施制备病毒。 　　使用八个具有最大测序深度的库（31s，20W，34W，14V，36S，40S，39S，39S和25V）分析了来自小鼠背部迷走络复合物的单核的转录组学数据31（扩展数据图6），该库对应于19,481 Neurons，包括13,481 Neurons，包括13,481 Neurons。基于来自Allen Brain Atlas的原位杂交数据，根据RNA揭示的签名基因的表达模式，将神经元簇分配到NTS或其他尾脑干区域。使用SEURAT59中的函数Sctransform使用正则化负二项式回归对每个库的唯一转录本的计数矩阵进行标准化。然后合并每个库的转换计数矩阵，并进行主成分分析，尺寸降低和群集识别。使用r（v.4.1.1）60,61中的seurat（v.4.0.5）进行了分析和数据可视化。 　　麻醉（65 mg -kg -1氯胺酮，13 mg kg – 1 xylazine）的年轻小鼠（2-5周），并放置在一个小型动物立体式框架（David Kopf仪器）中。直接NTS暴露会导致次要但不可避免的组织炎症，因此通过倾斜注射（距垂直于垂直，角度向后倾斜25°）进入NTS。在中线进行了三次注射（单侧）或五次注射（双侧），0.36 mm，0 mm和0.12 mm的侧线和4.40 mm，4.65 mm，4.65 mm和4.90 mm的Bregma。对于年轻小鼠，测量勃雷格马至较量的距离，并将沿延髓轴轴的注射坐标缩放为对应于核心的坐标，以bregma-tove-lambda的距离为4.2 mm。最多的玻璃移液器缓慢降低至4.8–5.0毫米的深度，对其他部位的注射量为4.3-4.8毫米。含有AAV1-SYN-H2B-JRGECO1A（0.6–1.3×1013基因组）的病毒溶液，AAV8-SYN-DIO-HA-HA-HA-HA-HA-HA-HA-HA-HAM3DQ-IRES-MCITRIN使用Nanoject III IMEXTOR（DRUMMOND）注入7.0×1012个基因组）或AAV9-CAG-FLEX-GFP（Addgene 51502-AAV9，3×1012基因组）（每毫升150 nl，每毫升150 nl，每毫升150 nl，2 nl S – 1）。小鼠在功能成像前恢复了10-21天。还在5周龄注射AAV的动物中也进行了对照实验，并在体内成像期间观察到类似的NTS反应（扩展数据图1D – F）。 　　AAV1-CAG-FLEX突触素-GFP由贝勒医学学院知识与发育障碍研究中心神经连接核心设施和波士顿儿童医院病毒核心设施包装。血清型1 AAV逆行标记其他具有高效率的外围感觉神经元62,63,64。麻醉年轻的VGLUT2-IRES-CRE，GPR65-IRES-CRE或GLP1R-IRES-CRE小鼠（65 mg kg – 1氯胺酮，13 mg kg – kg – xylazine）。胃和十二指肠通过一个小的腹部切口暴露。对于胃，使用汉密尔顿注射器将大约40次注射（10μl总数）AAV1-CAG-FLEX突触素-GFP放入腺体胃壁中。对于十二指肠，使用纳米注射器（drummond）将大约5次（500 nL总计5 nl S – 1）注射AAV1-CAG-FLEX-弹性蛋白-GFP进入了第一个1-1.5 cm的十二指肠。喉暴露在颈部腹侧的小中线切口中暴露，并缩回胸骨叶状肌肉。将大约5次注射（总计300 nL，5 nL S – 1）在甲状腺软骨的前缘和软骨下方的第一个环之间的喉壁中进行。注射后，用手术海绵清洁组织以吸收溢出的液体。用缝合线关闭切口，小鼠在钙成像前至少20天回收。 　　用氨基烷（2 mg g – 1在2次腹膜内注射2 mg g – 1相距至少20分钟）进行麻醉，手术至少在第二次氨基甲烷注射后至少20分钟），或在整个手术中以1.5-2.5％的insheate（在整个手术中1.5-2.5％，在最初的腹腔内注射65 mg kg kg kg kg – kg – 1 ketamine和13麦克kg）中。通过在实验过程中评估腿部捏和角膜反射来确保深度麻醉，并根据需要给予其他氨基甲酸酯（0.2-0.6 mg g – 1）。在定制的加热平台上对小鼠进行加热，并进行气管切开术以插入呼吸管。用固定在大约30°的螺距下的头部进行颅骨手术。去除颈椎脊髓肌肉，暴露出头骨和第一个颈椎。用牙科钻头切开小脑小叶VI – Ix的头骨，小脑的后部和大约小叶VII – X被轻轻吸气以暴露脑干的背面。流血停止后，将定制的钛头杆安装在平行于该区域Postrema表面的头骨上。柱子的前部用粘合剂水泥（C＆B Metabond; Parkell）固定在头骨上，并用粘合剂将后部密封到皮肤上。将一小滴kwiksil粘合剂（世界精密仪器）应用于脑干的表面，从圆形盖玻片（华纳仪器，尺寸为0。0，5 mm）切割的风扇形颅面窗口被降低到脑干的表面。调整了颅窗的角度，以使其平行于区域postrema的表面，并使用微型操纵器（World Precision Instruments）施加压力。仔细监测小脑下梗的血液流动， 由于没有运动伪像的稳定制剂需要在此步骤中施加足够的压力以阻碍血流。颅窗进一步固定在带有Metabond水泥的头骨和头杆上。水泥硬化后，取出微型操纵器，通过部分释放大脑压力确定，使小脑下花梗的静脉中的血流不再被阻塞。为了提高手术的成功率，手术前通常会对小鼠进行静脉注射PBS（300μL），和/或通过鼻锥给出氧气。 　　用配备有压电的物镜Z-Stepper（P-915，Physik Instrumente）和Olympus×Olympus×25水免疫物镜（Na的1.0，WD为8 mm）的Olympus FVMPE谐振两光子显微镜进行两光子钙成像。Olympus Fluoview软件用于收集两光子图像。带有分散补偿的蓝宝石激光器（Maitai EHP DeepSee，Spectraphysics）被调整为975–1,020 nm，并用570 nm长的二甲状腺和495-540 NM带通滤波器和495-540 Nm Bandpass Filt extumence extumence＆a 495-540 Nm Bandpass Filter the Gfp和gcamp6m and a 55 nm and a-559555555559555555555。JRGECO1A信号的575–725 nm带通滤波器。体积成像（1.25 Hz，512×512像素的分辨率）通常由五个焦平面80或100μm组成，覆盖了大型NTS面积（509.12×509.12×320μm），并允许同时记录大约2,800个神经元的每个实验。扩展数据中的神经元在10–12.5 Hz的单个焦平面上成像。物镜的前光圈测量的激光功率为35-90兆瓦，取决于颅窗和成像深度的质量。将小鼠小心地定位在头柱夹上，以平行颅窗和显微镜物镜的前镜头。为了确保解剖轴与显微镜探测器保持一致，使用区域Postrema作为地标进一步调整了偏航和滚动尺寸。 　　如前所述7，通过乳胶球囊的充气（Braintree Scientific，胃部为73-3479，73-3478）实现了机械器官的扩张，如前所述7。小啮齿动物喂食针（Cadence Science，9920）被固定在气球内，并通过硅管连接到注射器，这通过液体输注可以精确地控制体积。通过将放置在颅底的嘴中的气球充气来实现口腔的延伸。对于胃扩张，除去胃的含量，并在腺体胃的更大弯曲中进行小切口。气球进入了胃刺中，并通过切口部位周围的缝合线固定。在扩展数据中，图7g – i，胃前延伸涉及植入了林植入的气球的充气。通过将气球通过幽门括约肌的切口放入十二指肠灯泡中，可以实现十二指肠扩张，并被缝合线固定在括约肌上。为了确保仅将机械刺激分离为十二指肠或胃，在幽门括约肌周围进行了几乎完整的圆形切口，然后将缝合线绑在括约肌周围，这也防止了胃含量的溢出。空肠气球放在约40毫米的小肠中（蛋白蛋白的韧带）和幽门括约肌远端90毫米。将盲肠气球穿过Caecum – Colon交界处的切口，并通过缝合线固定。固定在所有气球上的油管都粘在皮肤上。对于图4A，B和扩展数据图10，将胃伸展为600μl，十二指肠延伸为115μl，空肠的115μl拉伸和8 s的喉水灌注在成像之前将其施加到小鼠上。 　　喉灌注基于先前具有修饰的协议12。在甲状腺软骨下方进行了大约五个软骨环进行气管切开术，并通过切口部位向甲状腺腺体推进了套管（PE 50管，脑形科学）。去除灌注套管和呼吸管之间的另一个软骨环以减轻张力。在气管，套管和呼吸管周围施加了其他kwik-sil硅胶粘合剂，以固定其位置，避免在刺激过程中机械位移，并将组织胶粘贴到皮肤上。对于图1G，H和扩展数据图中的刺激。3H，I和10，PBS使用蠕动泵不断地通过喉管缓慢灌注。为了刺激，将灌注液切换为高盐（10×PBS），25 mM柠檬酸（pH 2.6）或24 s的水（图1g，h和扩展数据图3H，I）或8 s（扩展数据图10）（图10），而无需更改流量。刺激之间的间隔为96 s（图1g，h和扩展数据图3H，i）或40 s（扩展数据图10），并在同一小鼠中重复两次刺激。对于其他数字中的喉刺激，通过用硅管连接到喉套管的注射器传递了100μl的水注射。 　　为了在十二指肠中施用化学物质，通过幽门括约肌的切口将插管插入十二指肠灯泡中，并在括约肌周围固定。由硅管制成的出口端口是括约肌远端创建的1.5厘米。包括盐水（HBSS）和葡萄糖（HBSS 0.3 m）在内的刺激通过单个插管（40 s以100μl）传递。在每个成像疗程结束时检查了盐水反应，以确保由于出口端口阻塞和相关的机械扩张而缺乏背景响应（扩展数据图4C，D）。 　　Bicuculline methiodide (Millipore-Sigma, 14343) was injected twice (each 100 pmol in 50 nl Ringer’s solution, 3 nl s–1) using a Nanoject III injector, with one injection 100 μm beneath the obex and a second injection 100 μm below the brainstem surface about 0.3 mm more caudal and 0.3 mm more lateral to the obex.在整个实验的其余部分中，对接受双瓜氨酸或CNO注射的小鼠进行了机械通风，并在注射双核氨酸后30分钟内进行了成像。CNO（PBS中的0.1 mg ML – 1，2 mg kg-1腹膜内注射，Tocris）在钙成像前15分钟注射，而1小鼠（在9中）（在9中）未显示CNO诱导的呼吸暂停。使用弹簧剪刀（精细的科学工具，15000-04）进行双侧进行双侧进行次肌迷走术（图1D），其切割在左右迷走神经的肝分支上方。钙成像实验是在包含各种CRE等位基因的小鼠上进行的，结果合并。 　　通过使用SUITE2P和/或TurboreG65,66将时间序列记录到参考图像中，可以校正横向运动。在校正的时间序列上平均的图像用于生成模板，以描绘JRGECO1A标记的神经元核的概述，如先前所述的39,67，使用快速归一化的交叉交er例程进行了半自动检测。简而言之，平均图像与近似平均核的内核交叉相关。然后，将图像用于生成二进制掩模，该掩膜划定了JRGECO1A标记的核。然后对面膜进行视觉检查，并手动纠正错误。通过平均目标区域内所有像素的强度来提取荧光强度（FT）。基线荧光（F0）通过在刺激开始前的24 s时平均JRGECO1A荧光来确定，并确定刺激前基线周期（S0）的标准偏差。ΔF/f计算如下： 　　除了十二指肠化学灌注外，ΔF/f痕迹被降低，以去除非平稳效应，例如光漂白。每个神经元的响应阈值（θ）设置为2.5×S0+F0。如果刺激期间的ΔF/f在θ上方（1）以上，则认为神经元对机械刺激表现出积极的反应，超过三个连续框架，（2）高于平均荧光强度（F0'）的两倍以上的两倍，在七个框架上，刺激启动和θ的七个帧强度（F0'）至少在两个连续的for中进行两次连续for for tus tust ot两次。如果刺激期间的ΔF/f和刺激偏移后的20帧在θ上以上的20帧，则认为神经元对化学刺激表现出积极的反应，在超过四个连续的框架上，高于标准偏差（s0'）的两倍以上的平均荧光强度（f0）的25次刺激效果和刺激效果的连续和（2）高于标准偏差（s0'）的两倍。手动检查了响应，很少（2.94％）由于运动伪像，反应被排除在外，而大量的基线漂移无法通过碎屑或通过碎屑对光路的物理障碍来纠正。图3C和扩展数据中报告的响应图3f，g，我在相应的时期（机械刺激和刺激周期的刺激周期加上化学刺激后的20帧刺激周期）在化学刺激后的20帧是最大的Δf/f减去θ，使用五帧的移动平均值使ΔF/f平滑后刺激后的20帧。在涉及十二指肠葡萄糖的实验中，使用至少有五个对每种刺激的神经元的视野（FOV）进行进一步分析。对于所有其他实验，使用了至少两个对所有分析刺激的反应性神经元的FOV。 　　Spatial distributions of neurons were depicted relative to the centroid of all stomach stretch-responsive neurons (Fig. 2b and Extended Data Figs. 1, 7b,d and 8), stomach site 2 stretch-responsive neurons (Extended Data Fig. 7h), duodenal glucose-responsive neurons (Fig. 2d), duodenal stretch-responsive neurons (Fig. 2g),JRGECO1A阳性，CRE阴性神经元（扩展数据图6B），缓慢适应神经元（扩展数据图2E）或对交叉抑制不敏感的神经元（扩展数据图10）。密度散点图（图2b，d，g和扩展数据图1E，H，2E，6B，6B，7B，D，H，8C，D，I，I，J和10A，D，G）是使用先前发表的algorithm68生成的，以揭示刺激对之间的隔离。这些图包括由两个刺激之一选择性激活的神经元，色尺度描绘了有选择地响应指示刺激的神经元的密度，在不同的器官之间单独调整。Spatial segregation between neurons that responded to two different stimuli was quantified (Extended Data Fig. 7f) using all pairwise distances between neurons responsive to the same stimulus or different stimuli, compared with data from a simulation in which neuron responses were randomly assigned based on the observed response frequency in each FOV (shuffled) to control for regional variation in neuron density.同样，使用相同结构（神经元到神经元或胎孔）之间的所有成对距离进行定量神经元和船单之间的隔离（扩展数据图8L）或不同的结构（神经元到船主），并将其与基于每个模拟的模拟的数据进行了比较。我们使用隔离指数（SI）来量化对两个不同刺激响应的神经元之间的空间隔离程度（图2E，h和扩展数据图7E，I） 在同一组动物中。计算每个神经元的SI为具有不同响应的神经元的平均距离与具有相似响应的神经元的平均距离之间的差异，在反应缓解后通过神经元距离标准化，并计算为如下。在同一图像中，x，y分别表示对刺激A和B响应的神经元的位置。为简单起见，我们写z =（x1，…，xn，y1，…，ym），让W为{1，2，…，n+m}的1,000个独立的随机排列。代表刺激A针对代表刺激B的神经元的神经元的Si计算如下： 　　当跨多个图像计算SI时，在将所有实验的神经元的平均真实数据（分子）（分子）分为平均值（分母）之前。为了对刺激对的空间分析，使用了至少两个神经元的FOV进行选择性调整到每个刺激的FOV进行进一步分析。由于样本量在图2B中是可变的，因此进行了附加分析，涉及每种刺激配对的小鼠相等数量的计算机随机选择，并且观察到了相似的结果（扩展数据图7B）。 　　使用富集指数来量化对每种刺激有反应的CRE定义的NTS细胞类型的相对组成（扩展数据图6D）。仅包括对任何刺激有反应的神经元；是响应刺激A的CRE阳性神经元的百分比，并且是对同一组动物中刺激A的CRE阴性神经元的百分比；富集指数的计算如下： 　　对于图4a，按以下顺序测量了反应：胃伸展（DS1），十二指肠延伸（DD1），同时胃和十二指肠延伸（DM1），第二胃伸展（DS2），第二次双肌张力张力（DD2）和第二次双肌张力（DD2）和第二次同时胃和Duododenal延伸（DM2）。仅当满足以下标准时，将神经元分类为被刺激混合物抑制：（1）DM1 <dd1，（2）DM2 <dd2和（3）（DM1+DM2）/2 <dd2 duodoDeNum响应；或（1）dm1 <ds1，（2）dm2 <ds2和（3）（dm1+dm2）/2 <ds2用于胃反应69。在扩展数据中进行了相同的分析，以进行涉及喉水和空肠膨胀的交叉抑制实验。图10。每个小鼠分析涉及对刺激混合物或未被刺激混合物抑制的神经元的单独响应定量，并包括所有观察到两种反应类型的动物。 　　对于扩展的数据图8，通过手动策划将H2B-JRGECO1A的弱荧光荧光进行计算去除。使用Canny Edge检测算法检测残留GFP信号的边缘，并通过对神经元反应特性或图像方向蒙蔽的实验者来确定每个GFP阳性BOUTON的质心。神经支配区域由对神经元反应和示踪剂注射部位视而不见的实验者手动确定。分析是在具有最分离神经元反应的成像堆栈中的焦平面上进行的。所有相应的刺激组中都包含了对多个刺激反应的多单位神经元的数据。所有分析均对FOV中的神经元反应视而不见。 　　使用GraphPad Prism（GraphPad软件）进行统计分析，并在图传说中报告了统计测试和样本量。所有重复都是生物学的，所有统计检验均两尾。没有使用统计方法来预先确定样本量，这些样本量基于我们领域的先前专业知识和出版物8,14,34。除手动确定轴突神经外，研究者没有对组分配视而不见（扩展数据8），这对组分配和神经元反应视而不见。没有使用随机分配方法来确定图3中的动物是如何分配给实验组的，图1DI – I，所有其他分析涉及同一动物中的​​刺激比较。在图2中。1F，H和3B，通过比较对相应数字中对所有刺激的所有响应的所有神经元的最大ΔF/f值来计算每个刺激对的皮尔逊相关系数。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。