Asgard Archaeon中的肌动蛋白细胞骨架和复杂的细胞结构

　　在2019年4月21日，在2019年4月21日，从斯洛文尼亚Piran海岸（45°29'46.1'46.1'46.46'n 13°36'10.0'e）中检索了从浅咸紫色管（40 cm水深，19.5°C，pH 8）从浅咸铜管（40厘米水深，19.5°C，pH 8）中检索的沉积物芯样品（长度约为60厘米）（长度约60厘米）（长度约60厘米）（长度约60厘米）（长度约60厘米）（长度约60厘米）。 　　将沉积物芯以3 cm的间隔切入厌氧帐篷（N2大气）内，每个馏分都放在50 mL圆锥形无菌离心管内，密封并在4°C下储存。来自不同馏分的沉积物约为0.5 g，用于DNA提取，随后靶向Lokiarchaeal 16S rRNA基因的QPCR分析（下面提供了QPCR条件）。与总DNA含量相关的最高相对16S rRNA基因拷贝的13–16 cm深层沉积物层选择了与总DNA含量有关（扩展数据图2）以进一步用于培养，该培养在120 mL的血清瓶中与丁基橡皮筋固定密封。总共将2克沉积物用作接种物，并测试了不同的培养基和顶空条件。如上所述，使用QPCR分析监测生长。140天后，在培养物中观察到了在50 ml无菌过滤的咸水中接种的培养物，这些运河中的含酪蛋白水解盐（0.1％（w/v）），20氨基酸（每只0.1 mm）和20°C下在80°C下孵育的氨基酸（0.1毫米）和20个氨基粉（0.1％），在80:20 n2 n2 n2 n2：0.3 co2（0.3 co2（0.3 co2）中）。为了限制细菌的生长，还补充了氨苄青霉素，卡纳米霉素和链霉素（每个50 µg ml -1）。每当可以检测到指数增长（在1-3个月之间）时，将培养物转移到新的培养基中。两次转移后，在此设置下无法再观察到增长，并在修改后的‘Ca中进行了下一个转移。P. Syntrophicum’MK-D1培养基7。在这些条件下进行了三次转移后，将培养基还原以进一步限制细菌的生长，并在最小的培养基中额外五次转移后，获得了高富集。Eventually, the growth medium composition (per litre) was as follows: 20.7 g NaCl, 5 g MgCl2·6H2O, 2.7 g NaHCO3, 1.36 g CaCl2·2H2O, 0.54 g NH4Cl, 0.14 g KH2PO4, 0.03 g Na2S·9H2O, 0.03 g cysteine·HCl, 0.5 ml of acid trace element solution,0.5 mL碱性痕量元素溶液， 1 mL SE/W溶液，0.1％酪蛋白水解盐（W/V）。包含的酸痕量元件溶液（每升）：1.491 G FECL2·4H2O，0.062 G H3BO3，0.068 G Zncl2，0.017 G Cucl2·H2O，0.099 G MNCL2·4H2O，0.119 G COCL2·6H2O，0.119 G Cocl2·6H2O，0.06 H2O和4.6 H. 2（37％）。碱性痕量元素溶液包含（每升）：0.017 g na2seo3，0.033 g na2wo4，0.021 g na2moo4和0.4 g naOH。将培养基调节为7.5，并含有氨苄青霉素，卡纳米霉素和链霉素（每个200 µg ml -1）。顶空气氛为80:20 n2：二氧化碳（0.3 bar），并且在20°C的情况下孵育培养物而不会发抖。 　　每14天采样一次2 mL培养物，并在4°C下以20,000克离心30分钟。将上清液丢弃，并将所得的沉淀重悬于700 µL的SL1缓冲液中，从核素质土壤DNA提取试剂盒（Macherey-Nagel）。其余程序是根据制造商的说明进行的。使用基于标准的苯酚 - 氯仿方案提取用于基因组测序的高分子质量DNA。根据制造商的说明，使用DSDNA HS试剂盒用Qubit 2.0荧光计（Invitrogen）测量DNA浓度。 　　使用ARB Tool54设计了Lokiarchaea特异性16S rRNA基因引物（LKF，5'-ATCGATAGGGGCCGTGAGAG和LKR，LKR，5'-CCCCGACCACTTGAAGAGAGCTG）。所有测定均以CFX Connect实时PCR检测系统（BIO-RAD）的一式三份进行，并使用CFX Maestro（v.2.3）收集数据。反应混合物（20 µL）包含：1×Luna通用QPCR主混合物（新英格兰Biolabs），每个引物的0.5 µm和5-10 ng的模板DNA。循环条件如下：95°C持续1分钟；然后在95°C和60°C下（用于退火和延伸）的40个循环为15 s，每个循环后都有荧光读数。通过将温度从60°C提高到95°C，以0.5°C的增量增加5 s，每次增量后，荧光读数以0.5°C的增量产生熔融曲线。从沉积物DNA扩增的Lokiarchaeal 16S rRNA基因片段用作定量标准。为了进行定量，在每个测定法中使用了10至108份的标准十倍稀释液的三份。这些反应的效率从90％到100％不等，R2值> 0.99。通过环境DNA的扩增子测序（Illumina Miseq）证实了引物特异性（扩展数据图3）。 　　从培养物中，将20毫升以20,000克离心30分钟，4°C。然后将沉淀重悬于mirvana miRNA分离试剂盒（Invitrogen）的600 µL裂解/结合缓冲液中。其余程序是根据制造商的说明进行的。通过在37°C下将样品与涡轮DNase（Invitrogen）孵育1小时，从而去除潜在的剩余基因组DNA。然后使用Lokiarchaeal 16S rRNA PCR检验确认样品中没有DNA保留。根据制造商的说明，使用Protoscript II第一链cDNA合成试剂盒生产cDNA。 　　靶向Lokiactin（GenBank：UYP47028.1，83F，5'-GCAGGAGAAGAGATCAGCCTCG; 337r，5'-AACCGGTGTTCGCTTGGAT）和肌动蛋白同源物（GenBank：GenBank：uip444126.1; 82f，5'-tggggggggggggggggggggggrcccc;5′-GGCCCCACGAACAGGATAAT), GenBank UYP44711.1 (361F, 5′-CCCTCCCAGACATTGCACAA; 731R, 5′-TGCGGGATCGACAGAATCAG) and GenBank UYP47647.1 (305F, 5′-CAAGGCTGGATCCCTTCAGA; 591R,使用Geneious Prime 2021.2软件（https://www.geneious.com）设计了5'-attgcgtgatatggtggcct）。使用培养DNA的温度梯度PCR来确定最佳退火温度，所有引物对使用的温度为60°C。QPCR程序和循环条件与Lokiarchaeal 16S rRNA基因扩增的条件相同。来自培养DNA的扩增片段用作标准。这些反应的效率从90％到100％不等，R2值> 0.99。通过熔融曲线分析评估引物特异性。 　　通过使用一般核核酸16S rRNA基因靶向引物对515F（5'-GTGCCCAGCMGCCGCGGCGGTAA）和806R（5'-GGGACTACHACHVGGGGTCTCTAAT）55进行了Barodecore（viennna）的BAIDNNA（VIENNNA），通过扩增提取的DNA进行扩增测序。Illumina Miseq（300 PE）平台。使用castadapt56处理原始读取，以删除引物序列，然后使用Qiime2 Pipeline57进行序列分析。简而言之，DADA2算法用于降低数据以及去除低质量的读取和嵌合体。具有100％序列同一性的序列聚集在扩增子序列变体中。使用SILVA数据库（版本138）和Q2-Feature-Claler-cllaseifier插件分配了扩增子序列变体的分类法。 　　将细胞固定在生长培养基中，并在室温下添加2.5％甲醛2小时。在此期间，将它们在1倍磷酸盐缓冲盐水中洗涤3次，然后在绝对乙醇和1倍磷酸盐缓冲盐水的混合物中储存在-20°C下（1：1）。这项研究中使用的寡核苷酸探针是一般靶向细菌的EUB338（参考文献59），甲烷菌粒靶向MG1200（参考文献60）和Lokiarchaea特异性dsag-dsag-dsag-gr2-1142（参考表5）。如先前所述61进行了DNA杂交链反应程序，并使用Gryphax（V.1.1.8.153）在Eclipse Ni-U Epifluorescom显微镜（Nikon）上成像样品。使用ImageJ62处理图像。 　　对于简读测序，使用Novogene的Novaseq 6000（配对端，150 bp）平台对我们富集不同时间点的三个样品的元基因组DNA进行了shot弹枪。使用Trimmomatic（V.0.36）63处理测序数据以删除Illumina适配器和低质量读取（SlidingWindow：5：20）。使用黑桃（v.3.15.2）64共同组装了修剪的读数，K-MER长度从21到111和“ - meta”选项不等。使用BINSANITY65，MAXBIN2（参考文献66），Metabat67和Concotoct68对重叠群超过1,000 bp进行了分组，然后使用DAS Tool69进行了重叠式解复和固定优化。使用CheckM53评估MAG的完整性和污染，并使用GTDB-TK（V.1.5.0; Classify_wf）70获得分类隶属关系。确定了一个Lokiarchaeal MAG（基因组长度为6,008,683 bp；完整性，90.9％；污染，7.9％）。 　　使用SQK-LSK109连接试剂盒进行了ONT测序的库构建，然后使用Flo-Pro002 FlowCells进行Promethion测序。使用DNA_R9.4.4预处理模型（Bonito BaseCaller -Fastq dna_r9.4.1），使用高精度ONT BASECALLER BONITO（V.0.3.6; https：//nanaporetech/bonito）处理FAST5文件。使用Porechop（v.0.2.4）71进行长阅读反复的和适配器的去除。使用纳米构成（v.2.8.0;纳米构成-l 1000）72去除读取短于1 kb的读数。我们使用Flye（v.2.8.3-B1695）73进行了长读的初始元基因组组件，并使用了“ - meta”选项。根据使用GTDB-TK（v.1.5.0）分类工作流（clastify_wf）70的重叠群的分类学分配，我们在单个非circular contig中确定了一个总长度为6,035,157 bp的lokiarchaeal基因组。为了获得完整的Lokiarchaeal基因组，采用了以下方法。长读取映射到短读组装的mag，并使用MiniMAP2（参考文献74）提取具有“ -ax map-ins”选项的长阅读组装的非圆形重叠群。使用SamTools75将映射的读数转换为BAM格式，并使用BedTools BamTofastQ76以快速Q格式获得读数。使用SEQKIT77工具去除重复的序列。长阅读重复数据删除后，使用Flye（-Nano-Raw）组装了其余的读数78产生圆形基因组。LOKI-B35基因组的抛光和验证是使用PILON79的四轮进行的，这是拟议的元基因组组件验证管道的一部分。 　　我们从NCBI和其他公共数据库中总共回收了167个优质ASGARD ASGARD ASGARD ASGARD基因组（完整性超过80％，污染少于10％）（补充表6）。为了重建生命的系统基因组，我们从以前的研究中收集了从多种细菌，非质量古细菌和真核生物（补充表8和9）中收集了23个核糖体蛋白标记（补充表7）。 　　我们的ASGARD基因组数据库中23个核糖体标记的识别和检索是基于使用Prokka（V.1.14.6）81进行的蛋白质组注释。在这项研究中重建了两棵系统基础树：（1）生命树，带有细菌，真核生物，非质量古细菌的核糖体标记和94个Asgard基因组的子集（补充表6）；（2）仅使用Thermoproteo的序列和我们数据库中存在的168个Asgardarchaeota基因组。使用MAFFT的L-INSI算法对齐核糖体标记（V.7.427）82，并使用默认参数83对BMGE进行修剪。两组核糖体标记均分别串联，导致两个多个序列比对，其中包括生命树和Thermoproteota Plus asgardarchaeota数据集的2,327和3,285个氨基酸位点。使用ufboot2（参考文献85），使用LG+C20+F+G模型在LG+C20+F+G模型下用IQ-Tree 2（参考84）进行系统基因重建。 　　'ca的蛋白质序列。L. ossiferum’和‘ca。使用Prokka（v.1.14.6）81预测了P. syntrophicum'。使用针对PFAM数据库（V.34.0）86的HMM搜索对所识别的蛋白质进行注释，并使用BlastKoala Online Server87分配了KEGG Orthology。 　　'ca的蛋白质组。L. ossiferum’和‘ca。P. syntrophicum’用作BLASTP搜索中的查询（E = 1×10-10），用于最近发表的直源基因ASGARD簇的集合，以获取Ascog数字和注释。根据以下标准选择了最佳匹配：如果爆炸对齐覆盖了70％以上的查询，并且序列身份大于25％，则分配了最佳命中的ASCOG注释；当最佳爆炸点不符合70％的阈值时，使用较低的查询覆盖率为30％，至少使用25％的序列身份来注释蛋白质结构域。ASGARD COG注释用于根据先前描述的505个Ascogs组成的策划ESP集识别ESP。'ca之间的平均氨基酸身份。L. ossiferum’和‘ca。P. Syntrophicum'使用比较（V.0.1.2）（使用“ AAI_WF”参数）（https://github.com/dparks1134/comparem）计算。使用ISESCAN88鉴定插入序列元素。 　　根据synima Pipeline90，基于所有使用BLASTP搜索执行的所有蛋白质比对，使用orthomcl（v.1.4）89鉴定了这两个蛋白质组之间的直系同源蛋白簇。Synima还用于鉴定'Ca之间的同步基因的链。L. ossiferum’和‘ca。P. Syntrophicum’基于Dagchainer软件91。基因组同步图是用Ridemogram92构建的。 　　根据使用LokiActins1的BLASTP搜索，鉴定出Asgardarchaeota基因组的肌动蛋白样蛋白作为针对我们策划的ASGARD基因组集的查询（E = 1×10-10，序列身份≥25％）。为了检索真核肌动蛋白序列的列表，根据登录IPR004000从Uniprot下载蛋白质，该蛋白与actin家族中存在的肌动蛋白域相对应。使用CD -HIT93（-C 0.99 -D 0 -G 1）聚类蛋白质以去除高度相似的序列。使用BLASTP使用Lokiactin作为查询，仅保留具有超过25％身份的序列。Eukaryotic actins and Asgard actin-like proteins were aligned together with bacterial actin homologues involved cell shape determination (MreB), magnetosome organization (MamK) and plasmid segregation (ParM) based on the structural information of homologues of the DASH database using MAFFT (v.7.490; --dash --localpair --originalseqonly) followed by a trimming逐步使用三光线（-gappyout）94。在Modelfinder95选择的LG+R8模型下，使用IQ-Tree 2.0（参考文献82）重建系统发育树。 　　对于SEM，Ca的丰富文化。如先前所述的96。使用Zeiss Auriga场发射扫描电子显微镜（Zeiss）进行SEM，以2 kV运行。 　　对于用于透射电子显微镜（TEM）或免疫原位的样品的常规树脂嵌入，样品分别使用Leica HPM 100和AFS2系统（Leica）进行了高压冷冻和冻结的取代。冻结替代培养基由含有0.5％戊二醛，0.5％甲醛和0.5％乙酸铀酰的乙醇组成。冻结替代程序，使用Lokiactin特异性的原代抗体（AB1，见下文）中的Epon环氧树脂中的以下嵌入和免疫原位，使用了先前对phaeodactylum tricornutum97进行的方案进行了。使用Ferio harveyi和Furoiosus进行了初级和二抗特异性的免疫元对照。估计了对照和'Ca的免疫粒子统计。L. Ossiferum’（补充表10）。使用Zeiss EM 912（Zeiss）系统进行透射电子显微镜检查，该系统以80 kV运行，并配备了Tröndle2k×2k 2K慢扫描CCD摄像头（TRS，TröndleRestlichtverstärkerSysteme）或Jeol F200（Jeol F200（Jeol），在200 kV中操作，CROSIICT，tröndleRestlichtverstärkerSysteme（TRS TRS），XAR A.（EMSIS）。 　　对Lokiactin抗体进行了针对Lokiactin特异性肽（AB1：CTFYTDLRVDPSEHPV; AB2：CSKNGFAGEDQPRSVF）的饲养，并通过ERISA测定法使用Eurogentec进行了验证。肽抗体由Eurogentec设计。 　　对于蛋白质印迹，将培养物的等分试样在4°C下以20,000克离心10分钟，在没有水解酪蛋白水解的基础MLM培养基中洗涤一次，并在955°C下含有1％（V/V）beta-mercapto-mercapto乙醇。样品以4–20％Tris-Glycine梯度凝胶（Bio-RAD）运行，转移到PVDF膜上，在TBST中用5％的牛奶粉末封闭，并用原发性和次级（山羊抗兔HRP，Invitrogen，Invitrogen，31460）探测。通过增强的化学发光（ECL）检测信号。 　　将培养物的等分试样固定在含氮气的含量涂层覆盖面上，并在氮气中用4％甲醛固定。盖玻片被阻塞并用3％（w/v）BSA和0.1％（v/v）Triton X-100进行渗透，随后用原发性（抗Lokiaciactin，1：100或1：500稀释）和二次抗体（二抗Aftike Af-Rabbit AF647，InvitRogen a-ivitrogen a-abbit a-abibiit a-abiber a-ab 3 abiber abiber a-1573，1.500 abiber;Star 580，Abberior ST580-1002，1：200被稀释），并用10 µg ML-1 Hoechst 33342（用于Airyscan成像的Thermo Fisher Scientific）或Spy505-DNA（Spirochrome（Spirochrome）（用于Sted samples））。盖玻片用vectashield（载体实验室，飞机扫样品）或延长钻石（Thermo Fisher Scientific，Sted样品）安装。使用带有Airyscan 2检测器的Zeiss LSM900成像样品和×63/1.4 Na Na Im-Rmmersion物镜。使用一个共聚焦成像轨道记录目标细胞的Z堆栈，以检测HOECHST信号和发射光线，并传输了一个单独的Jienyscan轨道，检测Alexa Fluor 647信号。使用Zeiss LSM加处理函数对共聚焦堆栈进行了反应，并用Zenblue（v.3.5）中的Zeiss关节反卷积（JDCV，15个迭代）处理Airyscan图像。在fiji98中进行了传输光通道的最小强度投影和单一共聚焦/大火切片的提取。使用配备有×100/1.4 Na油剥离物镜的Lei​​ca SP8 steD获取Sted图像。在堆栈的顺序成像轨道中检测到DNA和Lokiactin信号。图像与Huygens Professional（V.22.04; Scientific量成像; http://svi.nl）进行了反应。 　　将样品从氮气气氛下从培养物中取出，并以1：5的比例与10 nm BSA涂层的金珠混合。将样品保存在氮气中，直到冻结。然后，将3.5 µL的样品应用于发光的铜EM栅格（R2/1，Quantifoil），从背面自动印迹（使用一侧的Teflon板）99，持续5-7 s，并使用液体乙烷/丙烷100插入液体乙烷/丙烷100中，使用VITROBOT MARK IV（HELTOO MARK IV（热fishericixic）。 　　在配备有生物孔内图成像过滤器和K3 Direct Electron检测器（GATAN）的300 kV下，在300 kV的泰坦krios G4（Thermo Fisher Scientific）系统上收集了冷冻数据。使用Serialem102,103进行数据采集。由于非浓缩样品的低细胞密度，首先使用低放大倍数的多边形蒙太奇广泛筛选网格（×2,250）。鉴定目标后，使用剂量对称倾斜方案104获得倾斜序列，覆盖了-60°至 +60°的角范围，总电子剂量为140-160 e-2。Tilt series were either acquired at a pixel size of 4.51 Å at the specimen level using 2° angular increments between tilts and a target defocus of −8 µm or at higher magnification (pixel size of 2.68 Å) with 3° angular increments and a defocus ranging from −3 to −6 µm (for sub-tomogram averaging of the ribosome and reconstruction of the细胞骨骼细丝）。文章中显示的2D投影图像记录在×2,250（像素大小为39.05Å）的放大倍率，目标散焦为-200 µm。 　　使用IMOD105中的AlignFrame对倾斜序列进行漂移校正，并通过IMOD中的加权背部投影重建4倍的横线图。为了增强可视化和颗粒拾取的对比度，使用ISONET106进行了CTF卷入并过滤层。使用IMOD中的mtffilter对2D投影图像进行低通过滤。如先前所述，在蜻蜓（Object Research Systems，2022; www.theobjects.com/dragonfly）中生成了分割。简而言之，通过直方图均衡和UNSHAP滤波器进一步处理Isonet过滤的断层图，并在5-6个断层图切片上训练5级U-NET（2.5D输入5片），以识别背景体素，细丝，膜，膜，细胞表面结构和核糖体。所有神经网络辅助的分段均已在蜻蜓中清理，以二进制TIFF出口，并在IMOD中使用TIF2MRC转换为MRC。分割在Chimerax108中可视化。 　　核糖体的亚三图平均是使用Relion（V.4.0）109进行的。使用Dynamo110从56个以4个重建因子重建的跨断层图中手动挑选单个核糖体颗粒。将颗粒和原始倾斜系列的坐标进口到Relion（v.4.0）中，以生成伪子图在4（4,126个颗粒）下以4（4,126个颗粒）为单位。用核糖体参考（电子显微镜数据库：EMDB-13448）处理颗粒进行3D分类，该参考被低通滤波至60Å。处理了良好类（扩展数据中I类和III类的粒子图6中的I类），以3D自动限制为2和3D局部分类。最佳3D类（II类）中的颗粒以1的构造为3D重建，并在三个迭代Tomo CTF细化和框架对准后进一步改善了分辨率。从1,673个颗粒重建了核糖体以11.7Å分辨率的最终结构（扩展数据图6）。 　　将核糖体子图表平均值与使用chimerax中FitInmap的EuryArchaeota核糖体（PDB：6SKF，T。Kodakarensis111）的高分辨率结构进行了比较，以识别唯一的RRNA特征。为了可视化，使用Chimerax中的Molmap将高分辨率结构低过滤至11Å分辨率。大的亚基rRNA二级结构。使用R2DT112（可在https://rnacentral.org/r2dt上获得）预测L. ossiferum’和T. kodakarensis，以识别ASGARD特定的RRNA扩展Segments36的位置36，并将位置映射到结构托架中，以定义ES9和ES9和ES39和ES39的平均值。 　　使用类似的策略分析细丝，如先前的报告113,114中所述，并在扩展数据中总结了图9a。简而言之，使用Dynamo中的FilamentWithTorsion模型，从断层图中手动挑选了以4重建的断层图。进行细丝进行分割，以32.13Å的细分段距离进行，从而从CTF校正和剂量加权的半图中总共有10,031个段，分别为2个。这些分段的子Volumes进行了处理，以进行细丝分析（扩展数据）（图9）：从粒子坐标（或源自发电机得出的）计算的方向，然后以与无特征缸样参考的对齐为中心。（2）将重新定位的亚Volumes进一步旋转90°，直至平行于XY平面的东方颗粒。（3）提取沿Z轴的段的中央切片并投影以生成2D投影数据集。（4）对2D投影图像进行处理，以进行静脉重建分析115，其肌动蛋白参考（EMDB-11976）低通滤波至60Å。（5）将2D投影图像的方向映射到相应的亚卷中，并从相同细丝的片段的方向验证了细丝的极性，而使用Relion_refine的2D投影图像中的3D模型通过对齐3D模型，在3D空间中完善了片段的C entres entres entres entres。在重建过程中未应用极性投票结果，因为该分辨率不足以确定清晰的极性。然后处理具有精制方向的片段，进行第二次迭代细丝分析，其中相关分析中的参考已从2D投影图像中更新为3D模型。 　　经过三个轨道分析的迭代后，在最后一次迭代中进行了一个不采样的2D分类，以仅在具有可见特征的2D类中选择粒子。然后对颗粒进行处理以进行3D螺旋细化，以优化过程中的螺旋参数。总共3,161个2D投影来自亚参数，以31Å的分辨率确定重建的地图，而精制的螺旋参数为28.56Å（rise/subunit）和-168.50°（twist/subunit）。为了进一步提高地图质量，我们接下来使用Relion（V.4.0）109进行了子图平均图（扩展数据图9A）。从Dynamo中的56个断层图中手动挑选单个细丝，并分割为32.13Å。将13,569个细丝段和原始原始倾斜系列的坐标进口（v.4.0）以2为2的伪造因子生成伪子图形图。将粒子用于3D自动重新填充的粒子，而无需施加螺旋螺旋形，然后不采用3D分类而无需使用角度分类。在下一轮3D细化中，选择了优质3D类（I类和IV）中的粒子，其中在细化过程中应用和优化了先前获得的2D投影模型的螺旋参数。从用精制的螺旋参数施加的12,585个颗粒重建了24.5Å的最终结构（上升=27.9Å，扭曲= -167.7°）（图5C和扩展数据图9）。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。