核孔组装的定量图揭示了两个不同的机制

　　我们的数据表明，两个NPC组装途径明显不同。尽管以前已经证明，蒙霉菌和相间组装途径的分子需求不同5,6,7,8,9,10,11,12，但由于其罕见且零星的性质，对相间途径知之甚少。尽管对于一些NUPS15,16，但相对动力学可用于组成细胞质细丝，中央通道和核篮，或Y形和内环复合物的多个亚基，尚未研究在相互之间组装的Y形和内环复合物的多个亚基。在这里，我们为代表NPC的所有主要构件的十个NUP提供了对蒙脱病后和相间组件的亚基组成和化学计量的测量值。因此，我们的数据系统地揭示了两个组装途径之间的主要分子差异。在有丝分裂后组装过程中，Y复合物与中央环的组成部分迅速结合，建立内部（目前已经运输了胜任的孔），这是在添加细胞质或核丝蛋白之前的毛孔。相比之下，在相间组装过程中，Y-复合物首先与核丝蛋白TPR和细胞质丝Nup214的碱基结合使用，而稍后添加了中央环复合物。　　我们观察到的相间组装的分子途径对其独特的，内而外的机制做出了新的预测。该细胞首先建立了两个核Y环，并积累了其细胞质对应物的材料，然后将它们与核丝蛋白结合在一起，所有这些蛋白都在膜融合之前。该机制表明，包括细胞质细丝NUP214在内的细胞质Y形环在内膜逃避中已经“预建”，在融合后，它们必须以与完全成熟的孔相比存在非常不同的结构。令人惊讶的是，稍后添加了中央环复合物（这是成熟孔中的核和细胞质Y环之间的核心结构元件），这表明在相间组装过程中，在膜融合步骤后添加核转运控制。TPR的出乎意料的早期存在表明，尽管没有证明它是TPR在相间组装启动中的潜在作用。这种长长的盘绕蛋白多聚体蛋白成分可能与弯曲内部核膜有关以创建内陷，从而有可能通过展开或重组盘绕螺旋束1,2来提供力。相反，考虑到先前的报道，TPR与激酶ERK需要控制NPCS31之间的间距，基于TPR的信号传导在组装站点的选择中也可能很重要，以防止同时组装多个NPC彼此近距离接近，这可能会导致内部核膜的异常扭曲。　　我们关于人类细胞中相间组装的数据进一步揭示了出现酵母的差异，该酵母经历了封闭的有丝分裂，并且缺乏有丝分裂后途径32：（1）TPR同源物MLP1/2在酵母中聚集。（2）人类细胞表现出Y-复合成分的同步组装，而在酵母中，茎（例如Nup107）和Y型复合物的头部（例如，SEH1）并不同时组装；（3）在人类细胞中y-复合成分之后组装的中央环组成部分，而它们在酵母菌中一起组装32。这些差异可能是由于结构的基本差异（例如核层的存在）和/或人类和酵母细胞之间的核膜的细胞周期重塑（闭合有丝分裂）。　　我们的动态化学计量数据与先前的电子层析成像数据结合了有关膜拓扑和蛋白质体积的数据，使我们能够使用集成空间时空建模来预测NPC组装中间体的结构。我们专注于拓扑更简单的有丝分裂组装。最终的模型实现了有关蒙木损后组装的多个新机械预测，这将有助于指导未来的工作。例如，该模型表明可能需要进行中央环复合物，以防止有丝分裂后内质网中密封孔，并且中央通道NUP的疏水FG重复可能在将小膜孔扩张到大型NPC大小的通道中的小膜孔中发挥作用。我们的途径模型受到完全组装的NPC结构27,28的约束，其中包含16份NUP205和32份Nup62副本；因此，它没有解决如何在最近的结构研究中报道的NUP205和NUP62的其他副本，以及依赖于邻近性的生物素鉴定研究27,33,34,35。　　我们用于确定大分子组装途径的合并实验和计算方法可能受益于新兴方法提供的其他实验数据，例如用于成像NPC InterMediateS36,37的分子体系结构的3D超分辨率显微镜36，37和动态超级分辨率方法，用于映射现实时间38的结构变化。我们预计，此附加信息将使更复杂的组装机制进行更高的分辨率建模，例如，膜拓扑和蛋白质构象的相互作用NPC组件，涉及更大的实质性变化。　　在生理条件下，在单个蛋白质复合物水平上可靠地确定NUP的动态和可变拷贝数的需求进一步强调了以下事实：我们的基于活细胞的方法导致拷贝数估计值与十个研究后的NUP中的四种方法中的其他方法估计不同。该领域使用的主要方法，包括细胞种群的定量质谱23，单蛋白结构将单蛋白结构拟合到高度平均的冷冻EM密度33,34中33,34，以及对我们研究中使用的单个活细胞中荧光标记的敲入蛋白的校准成像，目前在这方面都有限制。例如，基于冷冻EM的平均值通常选择“完整”的NPC，以获得“完全占用”的平均NPC模型，而来自一个单元格中所有孔中的活细胞成像数据平均NPC NPC化学计量计，因此包括孔隙对孔的变异性，这会导致较低的估计值。相比之下，尽管荧光标签的纯合基因组编辑可确保融合蛋白的完整标记和生物学功能接近，但它仍然可以影响表达水平，这可能导致NPC内的不同占用率。　　根据这些方法上的局限性（NUP153，POM121，NUP205和NUP358），在十个研究的NUP中有四个是相关的。对于前两个，我们估算的估计值远低于完全组装状态的结构模型，我们将其作为途径模型的最终状态（图2和扩展数据图1和2）。因此，我们认为它们是在亚物理学水平上有效表达的，并将其化学计量标准化为成熟孔中预期的副本数量，以与其他NUP进行比较（图3A）。对于NUP205和NUP358，我们的拷贝数估计值比预期低40-50％，即使对于NUP205，我们的细胞系表达了融合蛋白的生理水平，而对于NUP358，这将其相关的表达水平降低（扩展的数据2）。需要更多的工作来可靠地衡量NPC的动态和可变组成，尤其是在其组装过程中，并将这些数据纳入建模。　　除了组装机制之外，我们在这里绘制的两种途径开始阐明NPC在真核生物中内膜系统进化过程中的作用3,4。我们推测，现代的NPC结合了古老的膜弯曲（例如，TPR等盘绕螺旋丝）和膜孔插头或扩张（例如，中央环复合物和FG-Repeat蛋白）模块，这些模块可能以前可能先前分别用于挤出细胞表面或在基因组围绕基因组中开放的传输通道。关键的进化创新可能在于结合和控制这些活动，这可能是核Y复合物的八元环架构。将来，比较真核进化树上不同物种的NPC组装途径可能有助于我们了解复杂的现代蛋白质机器的组装如何反映其进化起源。

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