叶绿素的无氧光子使用I型反应中心

　　为了培养Rci-Outimize氯反llexota成员，我们在国际可持续发展实验湖区（IISD-ELA）的国际可持续发展实验湖区（IISD-ELA）的季节性缺氧和铁质的北方盾牌湖（IISD-ELA）中取样了227湖（49.69°N，93.69°W）。IISD-ELA采样位点（49.50–49.75°N，93.50–94.00°W），位于加拿大安大略省肯诺拉附近，先前已详细描述了42,55,56,57,58。湖泊227在其缺氧水柱中产生了超过100μM的溶解铁（扩展数据图1C），并且由于长期的lake43实验性富营养化，缺氧比自然自然更为明显。我们于2017年9月从227湖上氧化湖上的照明部分收集了水，深度为3.88 m和5.00 m，并在120 ml玻璃血清瓶中以黑色橡胶止动物（Geo-Microbial Technology Company）密封的120 ml玻璃血清瓶中将这种水运送到实验室。 　　水补充了2％的淡水中型28 v/v，用8毫米的氯化物修改，并用无氧分配到120 ml的玻璃血清瓶中，并在最终压力为1.5 ATM的最终压力下用黑色橡胶止动（Geo-Microbial Technology Company）密封，并在最终压力下用黑色橡胶止动（Geo-Microbial Technology Company）分配。将瓶子施加在最终浓度为50μM二氟元或3-（3,4-二氯苯基）-1,1-二甲基尿素（Sigma-Aldrich）上，以阻止氧的光营养活性59。在实验开始（对于L227-5C培养物，从5.00 m样品中）进行尖峰，或在观察到氧气光营养生长（对于L2227-S17培养物中，从3.88 m样品中）进行峰值。在白光下在10°C（20–30μmol光子M-2 s-1;白炽和荧光源混合）在10°C下孵育，用于实验，从而导致菌株L227-5C富集菌株，或在远红色的LED LED下（使用Parsource LED LED BLIDE BLIDE BLIDED lED LADED PRIVED DELCHENT in LED LED BLIGHT;L227-S17。定期监测培养物，以使用铁毒素测定法监测亚铁浓度60，并在亚铁水平降低时用额外的淡水培养基或氯化亚铁对培养物进行修改，这可能是由于铁氧化所致（扩展数据图1D）。在液体培养基中最多进行了三种亚培养，用于耗尽铁铁的培养物（补充注释1），在亚培养过程中，液态淡水培养基的浓度逐渐增加到100％（即未稀释），含8 mm的氯化物。 　　初始液体富集后，使用深琼脂稀释系列61来稳定L227-S17培养物的生长并消除污染物。经过几轮琼脂培养（补充注释1）后，将含琼脂的培养基调整为以下组成。最终浓度为2.80毫米氯化铵，1.01 mm硫酸镁和0.34 mm氯化钙的溶液被高压灭菌并在N2气体下冷却。将磷酸钾单子和碳酸氢钠分别加入2.20 mm和11.07毫米的终浓度，以及0.5 ml L-1的痕量元素溶液SLA（可选的无硒酸盐）62、0.5 ml L-1的先前发射的维持溶液的浓度为0.5 ml livimin formation28，0.5 ml-1 a​​nd a colinite to-niite to-0.5 ml l-1 a​​nd selenien and selenien and selenien and seleniN tungram l-1-118.4 nm。与参考资料相比，维生素溶液中​​泛素钙和硫胺素的浓度加倍（分别为105 µm和296 µm）。在初始高压灭菌灭菌之前，可以选择添加芦他蛋白，最终浓度为2.0 µm。将培养基保持在pH 7.5，并在90:10或80:20 N2以下存储至二氧化碳（CO2）。我们将这种调整后的淡水介质称为“ CHX3.1培养基”。该培养基的最终浓度为0.2–0.8％熔融琼脂，2 mM亚铁氯化物和1.2 mm乙酸盐，同时制备琼脂奶昔管，然后在N2 -CO2顶空下保持止动。可以将三重洗净的Bacto琼脂（Becton，Dickinson和Company）或琼脂A（Bio Basic）用作琼脂来源。除非另有说明，否则使用CHX3.1培养基生长所有L227-S17琼脂培养基，包括0.2-0.3％（w/v）琼脂，2 mM氯化亚铁和乙酸1.2 mm，并在22°C下孵育。我们还丰富了培养物中的主要污染细菌，Geothrix sp。如补充方法中所述，L227-G1并获得了该细菌的闭合基因组仓。 　　对L227-S17和其他光养植物的培养物进行了光谱分析。通过ISL-150×150系列LED面板（CCS；最大强度约为30 cm的距离）在735 nm的光下孵育L227-S17的培养物，直到可见绿色或金菌落，并通过中心分解（补充方法）挑选并浓缩。还种植和收获了铁念珠菌和甲状腺梭状芽胞杆菌的培养物（补充方法）。为了获得体内吸收光谱，使用VP-050超声均匀均质剂（Taitec Corporation）在10 mM Tris-HCL（pH 8）中超声处理培养物生物量。进行超声处理1分钟（大约10 s开，脉冲10 s），然后在冰上进行1分钟，进行5个周期，然后以10,000g的速度离心5分钟。使用UV-1800 UV-1800可见扫描分光光度计（Shimadzu），将上清液的吸收光谱从300 nm到1,000 nm进行测量。为了在体外测量细菌叶绿素c物质，通过轻轻稀释的细胞在甲醇中稀释至少1:10提取颜料，然后以15,000g离心10分钟。然后，使用发现5-μmC18色谱柱（Supelco）通过高性能液相色谱（HPLC）分析提取物。HPLC的梯度条件如前所述（包括溶剂b的15分钟恒定保持）64。使用SPD-M10A二极管阵列检测器（Shimadzu）测量吸收光谱。在每个由此产生的HPLC谱中，所有保留时间峰在667 nm处的最大峰值突出性的3.5％以上均具有相同的相关吸收光谱峰。 　　对L227-S17的培养物进行了光 - 黑暗的生长测试，以测试对培养生长的影响。将培养物在光线（如上所述735 nm）或黑暗中孵育两个亚文化世代，并在有或没有醋酸盐修正案的情况下进行测试。所有治疗都将三份琼脂奶昔管（在亚文化第2代中使用0.2％w/v琼脂）。将培养物孵育，直到“轻”疗法中可见绿色或金菌落。为了从亚文化生成2个试管中收集生物量，在将大约5-10％的管子含量丢弃后，将每个管子的软琼脂在4°C下以12,000克的速度离心5分钟，然后去除上网和上层琼脂层。将颗粒洗涤一次10 mM Tris-HCl（pH 8），并在-30°C下冷冻，以进行微生物群落分析。DNA提取（如下所述）后，将复制样品的DNA提取物以相等的DNA质量比组合为16S rRNA基因测序。对于乙酸盐处理，由未卵形颗粒的一部分产生了部分体内光谱。如上面的体内光谱所述进行超声处理，除了两个超声循环而不是五个。然后将粗细细胞提取物在4°C下以5,000g的速度离心1分钟，并使用UV-1800 UV-1800紫外可见的扫描分光光度计（Shimadzu），将上清液的吸收光谱从500 nm到1,000 nm记录。使用650 nm至850 nm之间的线性基线校正将所得的吸收光谱标准化。 　　为了执行透射电子显微镜，从在白光下生长的L227-S17培养物（30 µmol光子M-2 S-1；白炽和荧光源混合），并使用琼脂酶消化残留的琼脂周围细胞。将一个单位的β-磷酸酶I（新英格兰生物标记）和10 µL的10倍反应缓冲液加入100μl细胞悬浮液中，并在42°C下孵育1.5 h。细胞沉淀和上清液的去除后，然后在4％戊二醛和4％多聚甲醛（溶解在磷酸盐缓冲盐水中）的溶液中在4°C下固定细胞2小时，并在4°C下储存。样品制备，包括用四氧化osmim固定和成像，在高级分析中心的分子和细胞成像设备（圭尔夫大学；补充方法）上进行。对于扫描电子显微镜，将培养物如上所述生长，但还包括120 µm硫化物。在高级分析中心（圭尔夫大学；补充方法）的分子和细胞成像设备上制备并成像，用琼脂酶消化的固定细胞被制备并成像。对于所有生理分析和富集培养物，不使用盲和随机化，因为实验者需要意识到样品之间的差异以适当处理它们，并且由于样本量很小。统计方法不用于预先确定样本量。 　　为了确认富集培养物的微生物群落组成，使用DNeasy Ultracy Microbial Kit（Qiagen）从沉淀的细胞生物量中提取基因组DNA。对于早期富集培养物（L227-S17和L227-5C亚文化世代0-1；补充数据1），在添加溶液SL以增强细胞裂解后，在70°C下进行了10分钟的处理。使用Qubit DSDNA HS测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）对所得的DNA提取物进行定量。然后使用三种不同的16S rRNA基因扩增子测序方法分析富集培养样品（扩展数据表1）。对于某些培养物，如前所述的67,68,69，通过普遍的原核生物PCR引物515F-Y65和926R66从提取的DNA中扩增16S rRNA基因的V4-V5区域。如前所述，在Miseq系统（Illumina）上进行的库合并，清理和测序进行了67进行，以生成2×250 bp配对的读数。样品在PCR之前随机分组，以避免库的样本量足够高时（即至少24个样品；对于早期的L227-S17和L227-5C的早期富集培养物就是这种情况，是亚文化世代0-1）。对于其他培养物，使用普遍的原核引物515F70和806R70通过生物工程实验室进行了V4区域进行扩增和测序。测序是在Miseq系统上进行的，以生成2×300 bp配对的读数。对于最终的培养物，使用通用细菌PCR引物27F71和1492R71，使用16S条形码试剂盒1-24（牛津纳米孔技术）扩增接近全长16S rRNA基因（V1 – V9区域）。通过Minknow软件，V21.02.1或V21.11.7（Oxford Nanopore Technologies），在R9.4.1的R9.4.1肺流量电池（Flo-flg001;牛津纳米孔技术）上测序所得的库。使用Guppy v5.0.16或v5.1.12（牛津纳米孔技术）进行基本呼叫 通过超精度模型。由于每个库中的样品数量少，因此未对纳米孔测序进行随机化和盲。 　　使用QIIME2（V2019.10）72通过Axiome3 Pipeline73，Commit 1EC1EA6（https://github.com/neufeld/axiome3）对V4 -V5区域样品进行序列数据分析，并具有默认参数。简而言之，使用dada2（v1.10.0）74对配对末端读取进行了修剪，合并和降解，以生成扩增子序列变体（ASV）表。使用Qiime2的Naive Bayes Classifier75对SILVA SSU数据库76,77，版本132进行了ASV的分类分类。使用Qiime2（v2019.7）制备了分类器培训文件。使用与上述相同的Qiime2和数据库版本，使用AXIOME3的提交E35959D分析单个样本（亚文化13.2A-3）。对于V4区域样品，使用Qiime2（V2022.8）直接分析样品。在使用castadapt（v4.1）78中删除向前和反向PCR引物后，将读取在3'端修剪，并使用dada2（v1.22.0）74合并并授予读数，以生成ASV表。For V1–V9 region samples, NanoCLUST commit a09991c (fork: https://github.com/jmtsuji/nanoclust) was used to generate polished 16S rRNA gene sequence clusters79, followed by primer trimming, 99% operational taxonomic unit clustering and chimera removal as described in the Supplementary Methods.然后将产生的扩增子序列（ASV或操作分类单元）归类为L227-S17菌株或Geothrix sp。L227-G1基于其完整序列的100％匹配，以参考16S rRNA基因序列在基因组测序中为这些物种产生。对于一个深入测序的V4区域样品（亚文化21.2；扩展数据图1F），与菌株L227-S17或Geothrix sp的菌株不匹配。在分类过程中允许使用L227-G1序列，以将分类学分类为四个低计量ASV（每个相对丰度小于0.3％），可能代表测序伪像。 　　通过短阅读的元基因组测序评估了早期液体富集培养物（亚文化世代0-1）的功能基因含量。提取基因组DNA如上所述，并在应用基因组学中心（TCAG；生病儿童医院，多伦多，加拿大安大略省）进行文库的准备和测序。Nextera DNA Flex库预备套件（Illumina）用于元基因组库的准备，并使用HISEQ 2500系统（Illumina）对库进行测序，并具有2×125 bp配对的末端读数，以获得5.0-730万读对。此外，如补充方法中所述，对L227-S17亚文化15.2的读云元素组进行了测序。使用ATLAS管道（v2.2.0）80分析所得的宏基因组，以生成一组解复的MAG，包括菌株L227-5C（补充方法）。 　　为了关闭L227-S17菌株的基因组，从L227-S17亚培养的琼脂奶昔管中挑选出一个大菌群19.9，该植物以735 nm的光（如上面的体内光谱）下种植0.4％（w/v）琼脂，并包括100 µm硫化物。从采摘的菌落中提取基因组DNA（如上所述），然后由生物工程实验室进行简短读取的元基因组测序。简短地，使用nextera XT DNA库预备套件（Illumina）对输入DNA进行处理，然后是Mgieasy循环循环（MGI），并进行了序列（MGI），并进行了序列序列。DNBSEQ-G400（MGI）生成330万读对。然后使用DNA清洁和浓缩器-5试剂盒（Zymo Research）浓缩来自亚文化19.9的同一DNA提取物的剩余材料，并用于长阅读测序。Using 225 ng of the DNA sample, spiked with 150 ng of Lambda DNA (EXP-CTL001; Oxford Nanopore Technologies), a long-read sequencing library was prepared using the Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK110; Oxford Nanopore Technologies) with long fragment buffer, followed by sequencing using a R9.4.1 Flongle flow cell (FLO-FLG001; Oxford纳米孔技术）。通过Minknow v21.02.1（牛津纳米孔技术），使用自适应采样在测序期间，在测序过程中耗尽了与Lambda噬菌体基因组（NC_001416.1）匹配的读数。使用Guppy 5.0.16（牛津纳米孔技术）进行了基本校正，具有超精度模型，产生了51万次读取，平均长度为2.1 kb。 　　从亚文化19.9的长阅读和短读测序数据用于生成菌株L227-S17基因组的混合组装。使用castadapt（v3.4）78对短读的5'端上的Nextera测序适配器进行了修剪。然后，使用Atlas的“ QC”模块（v2.8.2）80进行短阅读质量控制。在Atlas中，将基于MGI的短阅读库准备期间使用的测序适配器添加到“ apapters.fa”文件中，以促进置换适配器的删除。然后将质量控制处理的短阅读数据与长阅读数据相结合，以使用我们开发的名为Rotary（https://github.com/rotary-genomics/rotary，https://doii.org/10.5281/10.5281/zenodo.69951951951951951951951951951951951951995195195195）的自定义管道进行混合基因组组装和序列抛光。方法）。运行旋转后，使用CHECKM（V1.0.18）81在基因组中鉴定了单拷贝标记基因，并使用PGAP（V2022-02-10.build5872）82对基因组进行注释。使用Circos（V0.69.8）83构建了全基因组可视化，并使用生物繁殖（V1.81）84用于GC含量和GC偏斜计算。 　　我们使用HMMSearch（v3.1b2）85搜索了菌株L227-S17和L227-5C的RCI相关基因同源物，以及从PFAM86下载的Profile Hidden Markov模型（HMMS）。编码RCI（PSCA，PSHA或PSAAB; PF00223）的基因，一种RCI相关蛋白（与叶绿素相关的PSCD； PF10657），氯体结构单位（CSMAC; PF02043和PF11098）和PFMECERophy a-Pfm prophy a-Pinting prothiopting prothiopheraption; pf02043和pf11098）;查询。我们还询问编码编码RCI相关的铁 - 硫蛋白（PSCB; PF12838）和RCI相关的C型Cype细胞色素（叶绿素相关的PSCC或Heliobacterium与Heliobacterium相关的PETJ; PF106443或PF1342）的基因；非特异性。基因组被证实缺乏使用“ photo_rc” HMM（PF00124）的RCII相关的PUFLM基因，该基因靶向与RCII核心相关的PUFL和PUFM基因。我们使用了相同的HMM集（不包括上述非特异性HMM），其值阈值为10-1，以确认Geothrix sp中缺乏与光合作用相关的标记基因。L227-G1基因组。 　　使用I-Tasser Web Server87（分别于2019年5月和2020年3月访问），预测了在菌株L227-S17和L227-5C基因组中检测到的与PSCA样基因同源物相关的第三结构。通过序列比对鉴定了保守的[4FE-4S]聚类结合位点（请参见下面的比对方法），并在Jalview（2.11.2.7）88中进行了可视化。定制的HMM还用于类似PSCA的基因和由菌株编码的FMOA基因同源物。使用Clustal Omega（V1.2.3）89对准主序列，并使用HMMBuild（v3.1b2）85对HMMS进行对齐。由I-Tasser生成的自定义HMM和同源模型在与此工作相关的代码存储库中可用。 　　我们比较了菌株L227-S17的光萎缩相关基因与其他叶绿素门构件的光肉芽相关基因。如补充方法中所述，收集了叶绿素门的代表成员的基因组，我们使用该基因组通过Gtotree（V1.4.11）90和IQ-Tree（V1.6.9）91来构造物种树。在Gtotree中，使用74个单拷贝标记基因的“细菌”收集来产生串联蛋白序列比对，每个基因组的最低标记基因的最低阈值为30％。除两个基因组外，还含有氯反llexi rrmetagenome_bin16和‘ca。Thermofonsia的bin CP2-42A包含超过50％的标记基因。根据Modelfinder92确定的LG+F+R6进化模型，使用IQ-Tree与LG+F+R6进化模型的最大可能的系统发育构建。掩盖的串联序列比对的长度为11,700个残基。 　　基于Tang and Clayeragues 38和Bryant and Bryant and Caleagues4的基因组分析，选择了光合作用相关的基因，包括与光合反应中心，天线蛋白，氯体结构和附着，氯体结构和附着，氯体结构和固定相关的基因。参考序列是在叶绿素门的良好代表的基因组中鉴定的，即C. aurantiacus11，oscillochloris trichoides20和roseiflexus castenholzii94。使用这些参考序列作为查询来检测潜在的直系同源物，针对整个氯反列素基因组的收集进行了双向BLASTP95。Backblast Pipeline96，v2.0.0-Alpha3（https://doi.org/10.5281/zenodo.3697265）用于双向BLASTP，并且E值的cuts以E值和50％和50％和50％和50％和50％和50％和50％和50％和50％和50％和50％和50％的比例覆盖。与双向BLASTP搜索分开，我们确定了基于Ref的菌株L227-S17的其他基因。30。 　　除了在氯曲线杆菌门内的基因组比较外，我们还比较了由L227-S17菌株编码的关键光致萎缩基因与使用系统发育分析的其他已知细菌光嗜性的基因。与RCI（PSCA，PSHA或PSAAB）97，细菌绿色A结合（FMOA）37，叶绿体结构（CSMA）98，（细菌）叶绿素合成相关的基因（RBCL）在补充方法中所述的一组光子参考基因组中鉴定了99。使用Clustal Omega（V1.2.3）89对预测的主要序列进行对齐，然后进行手动检查。使用宽松设置（-t = p -b3 = 40 -b4 = 4 -b5 = h）的gblocks（v0.91b）100掩盖对齐，以保留具有远程同源性的区域。然后使用IQ-Tree（V1.6.9）91建立最大似然蛋白系统发育，并具有1,000个快速引导程序来计算分支支持值93。Evolutionary rate models, identified using ModelFinder92, were as follows: LG + F + G4 (RCI), LG + G4 (FmoA), LG + F + G4 (CsmA), LG + F + I + G4 (BchIDH and ChlIDH), LG + F + I + G4 (BchLNB and ChlLNB), LG + I + G4 (BchXYZ) andLG+I+G4（RBCL）。此外，掩盖序列比对长度为548（RCI），356（FMOA），74（CSMA），1,702（BCHIDH和CHLIDH），1,034（BCHLNB和CHLLNB），988（BCHXYZ）（BCHXYZ）（BCHXYZ）和412（RBCL）。 　　我们在IISD-Ela内采样了八个季节性的缺氧湖泊（湖泊221、222、224、227、227、304、373、442和626），以及一个永久性的参考湖（239湖）。在2016 - 2018年夏季或秋季，在四个主要采样事件（补充方法）中对湖泊的水柱进行了采样。通过封闭的系统齿轮泵和管线通过无菌0.22 µm seltivex聚乙烯基氟化物过滤器（Merck Millipore）收集水柱DNA的样品。水柱RNA样品类似地收集，除非滤滤器立即用1.8 mL的DNA/RNA屏蔽（Zymo研究）填充并用残留水清除。将过滤器一式三份收集（随后提取和分析）以进行RNA。在收集后，将STERIVEX过滤器冷却，直到在同一天返回采样营后将其冷冻（在-20°C下）。然后将过滤器冷藏到滑铁卢大学，并将其冷冻（在-20°C）进行冷冻直至加工。 　　使用Dneasy Powersoil或Dneasy Powersoil HTP 96 Kit（Qiagen）从Seltivex过滤器的切除膜中提取环境DNA。使用Zymobiomics DNA/RNA微型套件（Zymo Research）通过“ DNA和RNA平行纯化”方案进行环境RNA提取，并采用列内DNase I处理。在补充方法中描述了对使用sterivex过滤器的标准套件协议的修改。在提取DNA之前，将样品随机化，但是由于要处理的样品数量少，在RNA提取之前未进行随机化。统计方法不用于预先确定样本量。 　　美国能源部联合基因组研究所（劳伦斯·伯克利国家实验室）于2016年6月和2016年9月进行了元素测序。使用Nextera XT DNA库制备试剂盒（Illumina；包括库放大步骤），然后使用HISEQ 2500系统进行2×150 bp配对的读取测序，以生成44.1-13680万个读取对。麦克马斯特基因组设施（麦克马斯特大学，加拿大安大略省汉密尔顿）进行了2017年和2018年现场样品的元素测序。使用Nebnext Ultra II DNA库准备套件（新英格兰Biolabs）（包括库放大步骤）构建了测序文库，并使用用超声波（Covaris）剪切的输入DNA进行了测序。使用带有2×200 bp配对的读数的HISEQ 2500系统对所得库进行了测序，然后使用带有2×250 bp配对末端读数的HISEQ 2500系统进行第二次测序运行。由于序列误差，将2×200-bp运行的反向读数以114 bp的形式截断。在两次运行中汇总数据后，每个样本总共产生了20.6-6410万读对。McMaster基因组设施（McMaster University）还进行了2017年和2018年现场抽样的元文字测序。使用Ribo-Zero RRNA去除试剂盒（细菌； Illumina）进行RRNA耗竭后，使用Nebnext Ultra II RNA库中的Prep Kit进行Illumina（New England Biolabs）使用标准化的RNA输入，并无需方向RNA选择。在快速运行模式下以2×200 bp配对的读数为快速运行模式下的HISEQ 2500系统的一部分，对所得的库进行了测序。这是与2017 - 2018年宏基因组相同的测序运行。测序产生的55-1020万读对每次重复。总共测序了37个宏基因组，以及代表3个样本的9个元转录组（请参见扩展数据表3和补充数据4和5）。 　　使用Atlas管道（v2.1.4）80处理所有环境元基因组数据。使用默认设置，只是将读取映射的最低标识阈值设置为99％，仅将Maxbin 2（v2.2.4）和Metabat2（v2.12.1）设置为99％。为了提高基因组构造质量，在Atlas Run中包括了六个先前从湖泊227和442（参考文献103）的水柱中测序的六个湖泊宏基因组，以及来自附近和Meromict Lake 111的单一元素的单个元基因组，并在2018年7月在2018年7月进行了采样。整个Atlas管道，包括对原始读数的质量控制，单个样品的元素组装，元基因组套筒，所有样品中的垃圾箱的垃圾箱以及bin分析的垃圾箱，以及基因聚类和注释，均端到端运行。对于基因组固定步骤，将来自同一湖泊的所有元基因组样品汇总在同一“ Bingroup”中，从而可以使用来自同一湖泊的样品之间的差异丰度信息来指导基因组嵌入。运行地图集后，使用GTDB-TK（v0.3.2）104对模型进行了删除的MAG，该MAG依赖于GTDB（版本89）46。（GTDB版本89中使用的分类名称在整个工作中都使用。脱封MAG的平均完整性和污染分别为82.7％和2.1％。通过将映射到MAG的质量控制加工读数的数量除以该样品的组装读取的总数（即原始读取）来计算样品中每个MAG的相对丰度。 　　还以与菌株L227-S17和L227-5C相似的PSCA样基因的未组装读取水平进行搜索。使用fraggenescanplusplus105提交471fdf7（fork：https：//github.com/leebergstrand/fraggenescanplusplus）通过“ iLLUMINA_10”模型预测短肽序列。使用本研究中为PSCA开发的自定义HMM通过HMMSearch（3.3.2）85搜索肽序列，其值截止为10-10。然后使用BLASTP95搜索（BLAST v2.10.1）对菌株L227-S17和L227-5C的PSCA样序列进行过滤原始命中。仅保留了超过90％的身份和E <10-10的命中。还使用HMMSearch（3.3.2）85使用HMM（2009年6月版本）的分类标记基因RPOB（3.3.2）85搜索了预测的短肽序列，其截止值为10-10。在正常长度归一化后，将每个元基因组的滤波后PSCA样打击计数标准化为RPOB命中计数。分析中排除了Singleton PSCA样命中率。 　　使用Atlas Pipeline80处理元文字数据。Atlas Commit 59DA38F的“ QC”模块用于执行原始读取数据的质量控制。然后，使用自定义的Atlas叉，Commit 96E47DF（在https://github.com/jmtsuji/atlas的“ mapRNA”分支下可用，用于将RNA读取到从MetageNome Analyse（上）获得的模型集合（上述）和RNA READ COUNTES。简而言之，使用BBMAP（v37.78; Bushhnell B.，https://sourceforge.net/protojectss/protojectss/bbmap/），使用了编码的MAG作为Atlas“基因组”模块的输入。读取映射（“ contig_min_id”）的最低标识阈值设置为99％。在将映射到mags之后，使用tausurecounts107，在v1.6.4中汇总了mags中的metatranscriptome读取对基因的命中的计数。使用默认设置，除了以下标志：“ -t cds -g id -donotsort”。与此工作相关的GITHUB存储库中可用原始分析代码。 　　通过Atlas生成RNA读取数据后，在每个Metatranscriptome中计算了每个解换MAG的相对表达。为了执行此计算，将映射到每个MAG的RNA读取的数量除以映射到所有MAG的RNA读取的总数。将所得的相对表达值平均在复制元文字组之间。此外，我们根据基于DNAK的归一化和基因长度的归一化的RCI编码叶绿体编码相关的基因表达水平，我们平均基因表达水平（补充方法）在复制的元文字分解组之间。 　　所有现场样品均从安大略省西北部的IISD-ELA获得，并与IISD-ELA员工合作。IISD-ELA与https://www.iisd.org/ela所述的本地和区域社区合作。隶属于加拿大机构的研究人员将研究项目从研究设计到实施，拥有该项目产生的大多数数据和知识产权，并且是这项工作的合着者。在所有现场工作之前，实施了现场安全培训和风险管理计划。当地研究被认为是本研究的一部分。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。