古代人类DNA从旧石器时代吊坠中恢复过来

　　为了进行试剂测试，我们收集了十个未修饰的动物遗体，与人工生产中使用的材料相似，大小和形状相似，从中期的旧石器时代和早期的早期旧石器时代的沉积物Quinçay（7）和Lesottés（三个）（三个）（扩展数据表1和扩展数据图2）。这些标本的估计年龄范围为55至35 Kyr21,37,38。然后将非破坏性DNA提取用于在昆çay洞穴中发掘的15个骨标本，全部从归因于保留的植物技术造成的层，可能可追溯到45-35 ka21,37，到最初的上古地古地（45-43 ka）39 ka的最初上层（45-43 ka21,37）Cave40,41以及在2019年在Denisova Cave南部室的第11层（39-24 ka）（39–24 ka）的一台吊坠上发掘（扩展数据表1和扩展数据图3）。使用无菌手套挖掘并处理来自Bacho Kiro和Denisova洞穴的样品，并采取其他预防措施，以最大程度地减少现代DNA污染的引入。补充信息1中提供了有关样本和回收考古背景的更多信息1。 　　我们通过将每种试剂施加到通常转化为骨骼或牙齿工具和装饰物的两个更新世样本中，评估了四种试剂在非破坏性DNA提取中的潜在用途，最好选择一个骨头和一个牙齿碎片（扩展数据表1）。由于这些物体都不是完全干净的，并且在暴露于液体时可以释放沉积物微粒，因此我们还用水进行处理以获得微型形成变化的基线测量，这些变化与试剂的化学成分无关。试剂和孵育条件如下： 　　所有处理均在50毫升猎鹰管中进行，而无需搅拌，以避免对样品进行任何机械损害。为每个样品（从5 mL到17.5 mL）单独选择试剂量，以确保完全浸没。在室温高于室温的孵育中，在配备50毫升猎鹰管的插入物中进行了加热 - 透射仪MHR 11（Hettich Benelux）。对于90°C在磷酸盐缓冲液中孵育，设备的温度设置为99°C，以确保在孵育时间结束时到达管内90°C。处理后，将所有样品置于新鲜的50毫升猎鹰管中，并在室温下在水中孵育1小时以去除残留试剂。将样品在室温下干燥5天，然后将其返回到存储容器中。 　　在建立方案后提取之前和之后，使用定量3DST19跟踪骨或牙齿的微型摄影的变化19,43。生成网状的公理3D模型，并使用以下ISO 25178参数进行统计测试（配对学生的t检验，在处理之前和之后，α≤0.01）：平均粗糙度（SA），void量（VVV），峰值曲率（SPC）和峰密度（SPD）。补充信息2中提供了有关3DST测量结果的更多详细信息2。 　　此外，我们探讨了基于磷酸盐的非破坏性DNA提取与随后的14C年代的兼容性（补充信息3）。 　　由于磷酸钠缓冲液在第三次测量中并未引起古骨和牙齿的实质变化，因此我们使用该试剂使用该试剂从骨骼和牙齿粉中释放了一种先前描述的方法，该方法使用该试剂从骨和牙齿粉中释放出来，用于从完整的骨头和牙齿中提取非破坏性DNA。DNA的逐步提取使得可以在提取过程中密切监测不同DNA成分的释放（内源性DNA，来自周围沉积物的环境DNA，古代人类DNA和当今的污染），有可能允许对这些组件的推论，是否源于其对象的沉积物的痕迹，或者是从其表面构成的，它是否可以构成其表面或它的表面相互作用。然后，我们将此方案应用于Quinçay，Bacho Kiro Cave和Denisova Cave的15个标本。根据下面的四个步骤，在Max Planck进化人类学研究所的一间古老的DNA清洁室中进行了温度控制的非破坏性DNA提取。 　　此步骤仅针对新鲜挖掘的材料执行。首先，使用柔软的一次性塑料微库小心地将附着在标本上的沉积物团仔细去除。然后将样品放入50 mL的猎鹰管中，通过将20毫升至50毫升的水倒入管中，然后转移到新鲜的猎鹰管中。重复该过程两到三遍，直到不再将沉积物释放到水中为止。然后将含有被洗净的沉积物的水的管子以16,400克离心5分钟以颗粒，并将透明的上清液转移到新鲜的管中。随后对此过程收集的所有三种材料（手动去除的沉积物，通过离心水和透明水收集的沉积物颗粒）均经过DNA纯化（见下文）。 　　将每个清洁的试样放入50 mL猎鹰管中，将磷酸钠缓冲液（0.5 m磷酸钠，pH 7.0和0.1％Tween-20）添加到该试剂中，直到样品完全浸入试剂中（在5 ml和50 mL之间）。30分钟在室温下孵育后（无搅动），将缓冲液转移到新鲜的50毫升猎鹰管中。在室温（21°C，总共三个孵育）中重复此步骤两次，然后在37°C，60°C和90°C下各3次（有关所使用的设备和温度设置的详细信息，请参见上文）。在室温下进行最终在水中孵育，以去除残留试剂，并在室温下干燥标本5天。 　　为了促进随后的DNA纯化，通过使用Amicon Ultra Ultra-4中心过滤器使用Ultracel-3 Membranes（Millipore）（Millipore）（Millipore），通过将台阶（1）和（2）产生的水和磷酸盐缓冲液量的一半降低至50 µL和75 µL之间。为此，将多达4毫升或15 mL的样品添加到一个过滤器单元中，在离心机中以4,000克旋转，其在离心机中，其主动冷却单元设置为21°C。在样品体积超过4 mL或15 mL的情况下，将流通液丢弃，并用剩余的样品重新加载过滤器。最后，通过将4 ml或15 mL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0和1 mM EDTA）添加到滤波器顶部的浓缩样品中，并在4,000克旋转30分钟，从而进行缓冲液交换。用TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）填充上清液，然后填充300 µL，然后转移到新鲜的1.5 ml Eppendorf低键管中，并存储在-20°C下，直到进一步处理。 　　使用基于二氧化硅基于二氧化硅的古代DNA提取的方法在步骤（3）中制备的浓缩DNA级分中分离DNA。为此，使用结合缓冲液“ D”使用300 µL浓缩DNA作为DNA纯化的输入，并将纯化的DNA在50 µL洗脱缓冲液中回收。使用相同的方法但不同的输入体积进行了手动从人工制品或水洗液（沉积物颗粒）中取出的DNA提取。简而言之，通过将多达130毫克的沉积物转移到2-ml低位的Eppendorf管中，制备裂解物，加起来多达2 ml裂解缓冲液（0.45 m EDTA，pH 8.0，0.05％TWEEN-20和0.25 mg Mg-1蛋白酶K）（以100 ml的量表和0.25 mg）（1 ml）的含量为100 mg或0.5 mg）。旋转下37°C。使用500 µL或1,000 µL裂解物进行DNA纯化。 　　通过随后的样品制备和测序的所有步骤，将含有磷酸钠缓冲液或没有样品材料的裂解缓冲液的阴性对照与样品一起进行。对于样品的一部分，仅从在四个孵育温度中的每一个中产生的第一个磷酸盐缓冲液组中提取DNA。补充数据1概述了本研究中产生的DNA提取物。 　　在提取物中，使用Gansauge等人中描述的自动方案将10 µL转换为单链DNA文库。（2020）23。使用两个定量PCR分析确定了获得的独特库分子的数量和文库制备的效率45。然后，库被PCR46扩增和双重索引。从每个DNA分数中制备一个文库，除了从DCP1的第二和第三个90°C的磷酸盐分数外，准备了五个文库，每个文库都可以最大程度地提高序列数据的产量。沿每组提取和文库制备沿每组提取和文库制备携带未携带样品材料的负面对照。请注意，样品之间的文库制备效率有很大差异（图2和补充数据1），从Bacho Kiro Cave标本获得的磷酸DNA级数的平均范围从21.8％到DCP1的60.8％到DCP1的60.8％到QuinCimens的62.0％。 　　为了确定从人工制品中回收的DNA的分类组成，从本研究中生成的几乎所有提取物（所有样品和对照组，除了BKP3的第二和第三磷酸级分外，所有样品和对照组）都通过杂交捕获（通过探针集）（'aa75 nammian cenmians os a 242 sympssmant os of bkp3）富含哺乳动物mtDNA。在从相同的DNA提取物（即DCP1的90°C磷酸级分数）中制备几个文库的情况下，只有第一个文库富含哺乳动物mtDNA。此外，使用基于人类线粒体基因组的修订后的剑桥参考序列设计的探针集（“ AA163”）专门针对人类MTDNA富集。两种类型的mtDNA捕获都是使用Slon等人详细介绍的连续两轮自动捕获进行的。（2017）6或Zavala等。（2022）47。补充数据1提供了执行捕获反应的概述。 　　除mtDNA捕获外，从第一，第二和第三个90°C的DCP1磷酸馏分中制备了11个文库，通过连续两轮的溶液捕获量富集了人类核DNA的图书馆48。使用先前设计的捕获探针8的子集（名为AA204）进行了这种富集，针对两组SNP：（1）59,232 SNP，从6集“ Hominin诊断位点”中随机选择，在基因组中代表基因组中的位置，与其他哺乳动物不同，用于其他哺乳动物并用于量化粪faunal missim-Alignmentments;（2）411,492 SNP从“ 1240K”面板中选择（Vernot等人（2021）8）。这套SNP对于研​​究现代人口历史具有丰富的信息。这两个SNP组都位于人类与其他哺乳动物之间的较大进化序列差异的区域。 　　将富含mtDNA的文库合并到池中，并在配对端构型的Miseq Sequencer（Illumina Technologies）的多个车道上进行测序，并与两个索引读取（2×76 + 2×8循环）进行了测序。使用相同的配置在HISEQ 2500上对富含人核DNA的库进行了对单读配置（两个Illumina Technologies）的单读配置，并具有两个索引读数（1×76 + 2×8循环）。此外，直接在单读构型中直接对DCP1的第二个90°C磷酸盐部分制备了一个DCP1的磷酸盐分数（shot弹枪测序，无杂交捕获）。使用Illumina的Bustard工具进行了基本调用，并将序列分配给了他们起源的库，这需要与预期的索引组合进行完美匹配。Leehom（https://github.com/mpieva/leehom/tree/v.1.1.5)50用于修剪适配器，对于配对的数据，用于合并重叠的配对末端读取。 　　使用基于Blast和Megan（版本0.0.12）51的先前发表的计算管道6将哺乳动物或人mtDNA捕获产生的序列分配给了哺乳动物分类单元，并在Vernot等人的数据过滤中进行了修改。（2021）8（补充数据1和补充信息4）。简而言之，如后一项研究所述，通过需要至少三个独特的序列（涵盖参考基因组中的至少105个位置）来最大程度地降低分类单元的错误识别，并要求这些序列需要这些序列代表所有分类学鉴定的序列的至少1％。通过计算端子C到T取代的频率作为分子末端的脱氨酸速率的代理，可以单独确定每个家族（和每个库）序列的远古DNA的存在。然后将两个分子末端的替代频率显着高于10％（基于95％的二项式顺式），以作为来自各个家族的古代DNA的证据。 　　当前的DCP1分数中的人类污染使用了Software Tool Authentict（版本1.0.0）52估算了古代人类mtDNA，并且使用至少具有MTDNA基因覆盖的位置的位置，该位置将DCP1的第二个90°C分数估算为几乎完整的共识序列。然后将该共识序列用于单倍元2（版本2.4.0）53进行单倍群分配，并确定mtDNA基因组中的“诊断”位置，这些位置用于确定从DCP1恢复的每个DNA级数中对共有序列的支持（扩展数据表3）。使用BEAST2（2.6.6）54进行树木建筑和遗传约会。补充信息5中提供了有关mtDNA分析的更多信息。对于鹿DNA成分的遗传日期，从前60°C从DCP1获得的磷酸磷酸盐分数重建了几乎完整的WAPITI mtDNA基因组，以及八个古代Wapiti样品，以及详细介绍的八个古代Wapiti样品。 　　如前所述8，对人DNA捕获数据进行处理，并合并了对现代人类污染（基于身份验证）的最低估计值的数据，以进行进一步分析。使用SmartPCA（来自Eigensoft软件包8.0.0版）55进行了主要组件分析，包括当今和其他古代人物的序列数据。使用R软件包Ambixr（0.7.1）28，计算ƒ3统计数据，以确定DCP1之间的共同遗传漂移和选择现代和古代人口的选择，并使用D统计数据进一步评估其关系。通过比较X染色体的覆盖范围和从第二90°C的磷酸盐分数中获得的X染色体和常染色体的覆盖范围，对从DCP1中回收的人DNA分量进行了性测定，以进行性别测定。补充信息7提供了更多详细信息。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。