病毒编码的tRNA中和巴黎抗病毒防御系统

　　该研究中使用的噬菌体，细菌菌株和质粒列在补充表1中，并在补充表2中列出了引物。在补充1 mm Cacl2的Luria-Bertani（LB）培养基中，用T5噬菌体感染了T5噬菌体。除非另有说明，否则使用0.2％-ARA，0.1 mM异丙基 - 甲状腺乳糖苷糖苷（IPTG）和0.2 µg ML-1藻苯甲酸酯（ATC）进行诱导。 　　对于结构研究，将来自大肠杆菌B185（参考文献2）的ARIA和ARIB的编码序列克隆在T7启动子的控制下，将ARIB上的C-末端链球菌II的prsf-Duet载体克隆到PRSF-DUET载体中。为了与T7 OCR触发进行共表达，将ARIB的TopRim核酸酶灭活（E26A），并通过定向的诱变去除链球菌-TAG II。将T7 OCR蛋白的编码序列克隆到具有C末端链球菌标记II的PET-DUET载体中。对于体外结合测定，将T7 OCR蛋白的编码序列克隆到带有N端His6-TwinsTrep-Sumo标签的PET-DUET载体中。所有体内实验均使用PFR85进行，并用大肠杆菌B185和其天然启动子和诱导型PTET启动子上游编码巴黎。对于体内蛋白下拉，将C末端ARIB链球菌标记II引入PFR85。使用Gibson Method43或Q5位置定向诱变试剂盒（NEB）构建巴黎突变体。巴黎从T5噬菌体触发了Ptr1（T5 ORF094）和Ptr2（T5 ORF103），以及使用Gibson Methods在Arabad启动子的控制下将PBAD18载体克隆在PBAD18载体上。tRNA的上游和下游二十对碱基对，在克隆过程中保留了基因。根据基因组组件AY543070.1提供T5核苷酸位置。使用Sanger测序验证了所有构造。 　　ARIA和ARIB-Strep从BL21-AI细胞中的PRSF-DUET质粒（Invitrogen）中共表达。用0.1 mM IPTG和0.1％-ARA诱导以37°C至0.4-0.5 OD600生长的培养物。诱导后，将培养物在16°C孵育过夜。将细胞颗粒（在4°C下为3,000g，10分钟），重悬于裂解缓冲液中（25 mM Tris pH 8.5，150 mM NaCl和1 mM EDTA），并通过超声处理裂解。通过离心（10,000g，4°C下25分钟）去除细胞碎屑，并通过在5 mL链霉素树脂（IBA）上通过亲和色谱纯化Ariab络合物，并在裂缝buffer中用2.5 mM Desthiobiotin（IBA）洗脱。将洗脱蛋白浓缩（100K MWCO PES SPIN-X UF浓缩剂，Corning），并通过2％甘油的裂解缓冲液中的尺寸排除色谱（SUP200柱，Cytiva）进一步纯化。将感兴趣的分数组合在一起，并浓缩至5 µm（100K MWCO PES浓缩器，Pierce），并立即用于冷冻EM网格上的玻璃化。 　　为了确定体内蛋白质相互作用的伴侣，用PFR85表达的Arib-strep或用PBAD表达的OCR-Strep用作诱饵，并在大肠杆菌BW25113中进行了plldldowns。在37°C的LB培养基中，在带气盖的汤姆森烧瓶中生长了三升细胞培养物（每个烧瓶1.5升）。用0.2 µg mL -1 ATC或0.2％-ARA在0.1的OD600中诱导蛋白质的表达，并在达到0.8-1.0的OD600后通过离心收获细胞。如上所述处理细胞，并在两个堆叠的5 mL链球菌HP（Cytiva）柱上纯化链球菌蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）之后的蛋白质带的身份是通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法确定的。大约有三分之一的Coomassie染色带与凝胶裂解，并根据制造商的说明，用胰蛋白酶黄金（Promega）制备样品。使用Rapiflex系统（Bruker）获得质谱。 　　为了生产活化的ARIB，如前所述，在单独的培养物和细胞中表达了来自PFR85的Arib-Strep和PBAD的未标记OCR。将细胞培养物混合在一起，并在冰上被超声处理（60％功率，10 s脉冲，20 s脉冲，30-60分钟）在带有6 mM Sonotrode的Qsonica Sonicator上，然后对激活的Arib-strep纯化HP HP纯化。在用高分子量校准试剂盒（GE Healthcare）校准的SuperDex 200增加10/300柱（GE Healthcare）上进行的尺寸排除色谱法（GE Healthcare），确定了蛋白质复合物的分子量。 　　为了确定溶液中激活的ARIB的寡聚状态，我们进行了戊二醛交联测定法。将浓缩的ARIB等分试样与戊二醛（第253857.1611号，PanreAC编号）混合，最终浓度为0.025、0.125或0.25％V/V，并在室温下孵育30分钟。通过在pH 8.0处添加1 m Tris-HCl的一个样品体积和5倍浓缩SDS样品缓冲液的半样本体积，将反应淬灭。将样品在60°C加热5分钟，并通过SDS -PAGE分离。 　　带有N端His6-Twinstrep-Sumo的T7 OCR蛋白从BL21（DE3）细胞中的PET-DUET质粒表达。用0.5 mM IPTG诱导以37°C至0.4-0.5 OD600生长的培养物。诱导后，将培养物在16°C孵育过夜。将细胞颗粒（在4°C下为3,000g，10分钟），重悬于裂解缓冲液中（25 mM Tris pH 8.5，150 mM NaCl和1 mM EDTA），并通过超声处理裂解。通过离心（10,000g，4°C时25分钟）去除细胞碎片，并通过在5 ml链霉素树脂（IBA）上通过亲和色谱纯化HSS-OR，并用裂解缓冲液中的2.5 mM Desthiobiotin（IBA）洗脱。将洗脱的蛋白在4°C下与Sumo蛋白酶一起孵育过夜，然后将超过5 ml的Ni-NTA树脂（25 mM Tris pH 7.5，300 mM NaCl，1 mM TCEP和20 mM咪唑）孵育以除去Sumo-cleaved标签。将流通蛋白浓缩（10K MWCO PES SPIN-X UF浓缩剂，康宁），并在裂解缓冲液中通过2％甘油的尺寸排除色谱法（SUP6 10 300柱，Cytiva）进一步纯化。联合并浓缩了感兴趣的部分（10K MWCO PES SPIN-X UF浓度，Corning）。将裂解的OCR（3.8μm）与WT Paris（11.3μm）在37°C下孵育15分钟，然后在裂解缓冲液中通过尺寸排除色谱法（SUP6 10 300柱，Cytiva）在2％甘油中分析。将感兴趣的分数组合在一起，浓缩（10K MWCO PES SPIN-X UF浓度器，凝结），并通过SDS-PAGE进行分析（15％丙烯酰胺，150 V约1小时）。 　　所有样品均在1.2/1.3的1.2/1.3碳量化条纹上进行玻璃化，并使用Easiglow（Pelco）Glow-Discharge站（Glow 45 s，保持15 s）进行发光释放。在应用3 µL Paris+1 mMATPγs的3 µl之后，使用Vitrobot MK IV对网格进行双面印迹，在4°C下为4 s的力为5 s，相对湿度为100％。在液体乙烷中裂解后，将网格剪切并存储在液氮中。 　　对于从Arib下拉的巴黎，筛选了冷冻EM网格，并使用Talos Arctica显微镜（Thermofisher）在200 kV下运行并配备了K3 Direct Electron检测器（GATAN）收集的所有数据。Serialem44软件v.3.8.6用于自动数据收集。对于最终数据收集，以超分辨率模式收集了7,340部电影，像素大小为0.552Å，总剂量为56.42EÅ-2在50个子帧上分布。 　　为了确定ARIA的结构，准备样品进行冷冻EM分析，如上所述。筛选网格后，使用在200 kV下运行并配备了K3 Direct Electron检测器（GATAN）的Talos Arctica显微镜（Thermofisher）收集了10,340部电影。Serialem软件v.3.8.6用于自动数据收集。视频以超分辨率模式记录，像素大小为0.552Å，总剂量为56.31eå-2在50个子帧上分布。 　　所有数据均在CryoSparc v.4.41（参考文献45）中处理。在贴片运动校正和对比度传递函数（CTF）估计后，丢弃了CTF拟合的显微照片，丢弃了5,998部粒子采摘的电影。在处理200个显微照片的子集后，显而易见的是巴黎综合体的ARIA6 -ARIB3组装。使用此低分辨率初始体积，使用Chimerax v.1.7中的Molmap命令（参考文献46）中使用Molmap命令，将Aria和Arib的AlphaFold2预测的Aria和Arib的结构拟合到地图中。该卷被导入冷冻量，用于生成用于颗粒拾取的模板。总共提取了4,078,384个颗粒，在初始二维分类后，保留了1,643,515个颗粒以进行进一步处理。使用三类缩写重建对这些粒子进行分类，该重建显示了两个垃圾类别和与包含940,782个颗粒的组装的巴黎复合物相对应的体积。经过第二轮二维分类后，保留了934,763个颗粒，并进行了另一轮从头开始的重建和异质性细化。这产生了一个共识体积，其中包含532,010个颗粒，具有两个ARIB亚基的构象异质性，其中一个不对称单位的配合物很好地排列。掩盖的局部细化用于确定该复合物的一个不对称单元的3.2-Å分辨率图。与532,010个颗粒的共识精炼还进行了多个掩蔽的三维分类，以分离顺式和反式排列中的颗粒。完全组装的巴黎复合体基于三维变异性分析表明了灵活性，这限制了完全组装的复合物的可实现分辨率。EMDB-42719、43103和43104的局部细化和完整复合物的密度图都可以找到，并且可在Empiar-11832上找到原始显微照片。 　　所有数据均在CryoSparc v.4.41中处理。在收集的10,340部电影中，根据上述的CTF拟合标准选择了9,399部进行进一步处理。使用斑点直径为200Å，提取颗粒并进行二维分类。在二维类别中，存在两个不同的大分子复合物，其中一种被解释为巴黎复合物的芳香脚架，另一种被解释为对应于RNA聚合酶。 　　从与芳基六聚体相对应的7个选定类中，选择了667,479个颗粒进行下游细化。从这些颗粒的两类缩写重建中，保留了392,989。通过多类的重构和异质改进的迭代分类产生了包含62,732个颗粒的体积。ARIA亚基可以适合这种密度，但是较差的分辨率使这种结构与完整的巴黎复合体中鉴定出的ARIA支架无法区分。没有观察到OCR的密度，这表明可能存在多种结合位点，或者在柔性状态下将OCR连接到ARIA上。密度图可在EMDB-43105和Empiar-11833的原始显微照片上找到。 　　为了确定巴黎复合物的不对称单元的结构，从CryoSparc局部改进中获得密度的半映射，然后作为Deepemhancer v.0.14（参考文献47）的输入提供，以进行地图锐化。然后将Aria和Arib的Alphafold2预测的结构停靠到MAP密度中，并使用ISOLDE v.1.7.1（参考文献48）Chimerax v.1.7中的分子动力学模拟环境改善了地图对模型拟合。在初始平衡之后，使用Phenix V.1.20.1（参考文献49）保存PDB文件并用作实际空间改进的输入。初步完善后，使用COOT V.0.9.8.1（参考文献50）手动检查和修改了有问题的区域，并从低于4Å的区域中取出侧链。在解决冲突和非连杆侧链方向之后，在近代进行了迭代改进，直到ClashScores，Ramachandran和侧链异常值未能改善。最终模型和相应的地图已沉积（PDB ID：8UX9，EMDB-42719）。 　　为了生成巴黎复合物原子模型的生物组件，从CryoSparc获得了对应于顺式和反式的颗粒的C3对称和不均匀的颗粒的半映射，并在Deepemhancer v.0.14中得到了锐化。在使用Chimerax v.1.7 FitMap命令将非对称单元的三个副本拟合到顺式和反式密度图中后，然后使用phenix中的FIND NCS工具来计算配置组合形式的适当对称性操作员。将这些对称算子应用于非对称单元，以使用Phenix中的Apply NCS工具生成生物组件1和2。在EMDB-43104和EMDB-43105分别获得了巴黎复合物的顺式和反式方向的地图。 　　使用6 µM OCR，100 nm的巴黎和128 µM ATP测量ATPase活性，并补充了10 nm [α-32 P] -ATP（Perkinelmer）。反应缓冲液包括20 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mm氯化钠，1 mM DTT和5 mm氯化镁。将反应在37°C下孵育，并在1、2、4、8、16和32分钟将10 µL等分试样用苯酚淬灭。对于仅触发反应，将100 nm OCR与128 µM ATP混合，并在反应缓冲液中补充了10 nm [α-32 p] -ATP（Perkinelmer）。将反应在37°C下孵育32分钟，并用苯酚淬灭。使用T4多核苷酸激酶（NEB）创建ATP和ADP制造商。T4 PNK与128 µM ATP混合，并在T4聚核苷酸激酶缓冲液（NEB）中补充了10 nm [α-32 p] -ATP和1 mM DNA寡核酸ATP；然后将该混合物在37°C下孵育1小时。所有反应产物均提取并在二氧化硅TLC板（Millipore）上分辨出来。将反应产物在TLC板的底部上方2.5厘米发现。将板放在TLC的开发室中，填充约1.5厘米约1.5厘米（0.2 m碳酸氢铵pH 9.3，70％乙醇和30％的水），并在室温下用铝箔覆盖4小时。然后将板暴露于磷光筛，并使用台风磷光成像仪成像，并用ImageQuant软件包（Cytiva）进行定量。 　　与WT系统相比，通过使用噬菌体T7进行斑块（EOP）测定的效率来测量巴黎突变体的活性。大肠杆菌K-12 MG1655携带每个ARIA或ARIB突变体，对照质粒PFR66（SFGFP）或WT PARIS系统（PFR85）在LB+Kanamycin（50 µg ML-1）中生长过夜。通过将100 µL的固定培养物与5 ml lb+0.5％琼脂混合，制备细菌草坪，并将混合物倒入含有lb+kanamycin（50 µg mL -1）的培养皿中。在每个板上发现了T7噬菌体的高额定量的十倍连续稀释液，并在37°C下孵育5小时。如上所述，用大肠杆菌BW25113进行了带有T5和T5样噬菌体的EOP，除了将板在37°C下孵育过夜，并用1 mM CaCl2添加了顶部琼脂。通过用指定的-ARA量补充顶部琼脂来实现tRNA基因或噬菌体T5片段的诱导。在至少两个独立的重复下进行牙菌斑测定。 　　为了监测液体中巴黎+（PFR85）和巴黎（PFR66）培养的T5MOS噬菌体感染的动力学，我们使用了Enspire多模板读取器（Perkinelmer）。将过夜的细菌培养物在LB培养基中用适当的抗生素稀释100倍，并在补充1 mM CaCl2的10 mL lb中生长在37°C下生长。在OD600 0.6时，将200μl等分试样转移到96孔板上，并在指定的MOI处感染。监测光密度10小时。所有实验均在三个生物学重复中进行。 　　在存在T7 OCR或PTR1和PTR2的情况下，巴黎的毒性是使用现场测试测定法测量的。巴黎+（PFR85）和巴黎 - （PFR66）携带PBAD载体编码指示的触发的培养物在37°C的10 ml lb中生长过夜。将固定培养物稀释至OD600 0.6，并在LB或最小中元（M9（M9）（5％V/V lb）的琼脂平板上补充了0.2％-ARA，通过连续十倍稀释。没有诱导的对照板含有0.2％的葡萄糖，以防止阿拉伯启动子泄漏。为了评估巴黎ARIA D401N/E404Q突变体的毒性，我们使用了PFR85（来自本地启动子，BW25113大肠杆菌菌株驱动的巴黎表达）或Praw 464载体（来自T7启动子T7启动子BL-21（DE3）E。Coli菌株的Paris过表达）。如上所述将培养物铺在M9上，并用1 mM IPTG诱导了巴黎的表达。OCR表达以0.2％-ARA的pBAD驱动。 　　为了评估与激活的巴黎相比，单独评估ARIB表达的毒性，用编码巴黎（Praw 464）和Arib（Praw 466）或巴黎（Praw 464）和OCR（Praw 472）的质粒（Praw 466）和Arib（Praw 464）转化了大肠杆菌BL-21 AI细胞。在补充适当的抗生素的LB中培养过夜后，将细胞稀释至LB+抗生素中的OD600 0.1，然后生长至OD600 0.5。细胞达到OD600 0.5之后，将200μl培养物添加到补充抗生素的800μL培养基中，并将0.4％葡萄糖，0.2％-ARA和0.1 mM IPTG或0.5％-ARA和0.5％-ARA和0.1 mM IPTG加入。接下来，将每种培养物的200μl等分为96孔板（常绿，第222-8030-01F）。使用敏捷的Biotek Cytation5读板读取器将其固定在30°C的情况下，并连续线性摇动来监测生长，并且每5分钟读数每5分钟读取15 h。 　　携带质粒PFR85（PTET ARIAB），PFR85ΔARIA（PFR99），PFR85ΔRIB（PFR100）或PFR85-ARIA（R212*）（R212*）（PFD294）的大肠杆菌MG1655菌株，PFR85（PFR85ΔRIA（PFR99）（PFR99）（PFR99）（PFR100）（PFR100）（PFD294），该杂物在aria中引入了aria，Truncatib inia nuront aria，truncatib1：100在LB+Kanamycin（50 µg ML-1）中的隔夜培养物中，并在96孔板中排列。然后，在37°C的无限M200 Pro Proper Plate读取器（TECAN）中，每10分钟在OD600的OD600中每10分钟监测30小时的生长。使用GraphPad Prism v.10.1.2分析了三种生物重复的吸光度值。标准的双向方差分析用于计算相对于WT巴黎的生长速率的P值。 　　将携带Pbad OCR的巴黎+（PFR85）和巴黎（PFR66）稀释1：100，并在37°C下补充适当的抗生素的LB中培养。当OD600达到0.4时，将等分试样与DAPI（Invitrogen）以1 mg ml -1的最终浓度和碘化丙肽（Invitrogen）（Invitrogen）在1μgmL -1的最终浓度中混合，并在黑暗中在室温下在室温下孵育5分钟。在75×25 mm2显微镜载玻片上制备LB+1.5％琼脂糖板（约0.2 mm厚）（Fisher Scientific）。琼脂糖平板包含相同浓度的染色染料，可选地补充0.2％-ARA，以诱导OCR表达。将大约1μl染色的细胞放在琼脂糖板上，在干燥1分钟后，板被小（22×22 mm2）盖玻片覆盖（Fisher Scientific）。成像是在尼康Eclipse Ti-e倒落叶显微镜上进行的。在传输光通道（200毫秒暴露）和DAPI（Filterset Semrock DAPI-50LP-A，200毫秒暴露）和碘化丙啶（Filterset TXRED-4040C，200 ms暴露）中对每个视野进行成像。 　　在不同的时间点（15、30、60和120分钟）中提取总DNA，有或没有DAPG，以在巴黎存在下诱导OCR的表达。根据制造商的说明，使用向导基因组DNA纯化试剂盒（Promega）提取DNA，并在0.1 mg ML -1的情况下用RNase处理。将总DNA的每个样品加载在1％琼脂糖1×TAE凝胶上。 　　根据先前描述的方法51，进行了TUNEL分析以在体内估计DsDNA断裂的积累。带有PBAD OCR载体的巴黎+（PFR85）培养物生长至OD600 0.3，然后用0.2％-ARA诱导2 h。作为阳性对照，用0.1％H2O2处理细胞以诱导DNA断裂的积累，然后通过离心收集2 mL的细胞，并根据标准方案（Tunel Assay kit - FITC，no。AB66108，ABCAM）处理。在异硫氰酸荧光素通道中，用细胞体细胞图仪（Beckman Coulter）对荧光素异硫氰酸荧光进行测量。每个样品中总共收集了100,000个事件，分为三个生物学重复。在FlowJo v.10（参考文献52）中对数据进行了分析和可视化。 　　携带质粒PFR85（PTET ARIAB）和PFD250（PPHLF OCR）或对照质粒PFR66（SFGFP）（SFGFP）和PFD245（PHLF SFGFP）（PHLF SFGFP）的大肠杆菌MG1655（PPHLF OCR）（PPHLF OCR），在LB+Kanamammy cincin（50）中稀释1：100µg mL -1）+氯霉素（20 µg ml -1），生长至OD600 0.3。然后加入DAPG 50 µm，然后再孵育15和30分钟。为了将巴黎激活与用氯霉素治疗的效果进行比较，将携带PFR66的大肠杆菌MG1655从LB+Kanamycin（50 µg mL -1）中的过夜培养中稀释至OD600 0.3，然后添加了氯霉素（20 µg ml -gramphenicol（50 µg ml -1）），然后加入20 µg ml -ml -ml -1 15分钟。如参考文献中所述，用4％甲醛（Sigma-Aldrich，目录NO。F8775）进行细胞固定。53。用300 mm甘氨酸在4°C进行20分钟进行甲醛。使用Arima试剂盒进行HI-C实验。使用Covaris（DNA 300碱基对）对样品进行超声检查。 　　根据制造商的说明，使用Invitrogen TM Colibri TM PS DNA库准备套件进行配对末端测序的样品进行制备；详细协议可在参考文献中获得。53。读取与Bowtie2 v.2.4.4对齐，并使用默认参数使用Hicstuff V.3.0.3（https://github.com/koszullab/hicstuff）生成HI-C触点图，并使用HPAII酶进行挖掘。如参考文献中所述，对触点进行过滤。54和PCR重复（定义为完全相同位置的配对读取映射）被丢弃。矩阵以4 kb为单位。使用ICE算法55进行平衡的归一化。对于所有比较分析，将矩阵降采样至相同数量的触点。如参考文献中所述，将HI-C信号计算为相邻5 kb箱之间的接触。56。为了将该信号与其他基因组学轨道进行比较，我们以所需的分辨率进行了汇总。 　　如先前所述57进行的，在实验中使用3H-MET，3H-U和3H-T进行代谢标记，并进行了较小的修改。大肠杆菌BW25113巴黎+（PFR85）菌株用带有OCR触发的PBAD质粒转化（用于-ARA-诱导表达）。最初将转化的细胞铺在补充有100μgml -1氨苄青霉素，25μgml -1卡纳米霉素和0.2％葡萄糖的LB板上。使用单独的大肠杆菌菌落接种，在定义的Neidhardt Mops最小培养基中制备了2个ML液体培养物（补充了100μgml -1 -1氨苄青霉素，25μgml -1 Kanamycin，0.1％Casamino -1％casamino casamino -casamino -casamino -1％葡萄糖和1％葡萄糖），并在37°°C下过夜。随后，在MOPS培养基中的125 mL圆锥瓶中制备实验性20 ml培养物，并补充了0.5％甘油，100μgml -1 -1氨木氨基链霉素和25μgml -1 kanamycin，以及在最终浓度的25氨基浓度（甲基甲酸）的一组19氨基酸（缺乏）。这些培养物在OD600 0.05接种，并在37°C下生长，摇动至OD600 0.3。此时，将1毫升等分试样（指定为诱导零时间点）转移至包含10μL相应的放射性同位素（3h-met（0.77μci，perkinelmer），3H-u（0.1μci，perkinelmer）或3H-t（0.1μCI，perkinelmer）或前3H-T（0.1μCI，perkineLmer）的1.5 mL eppendorf管37°C。同时，通过将-ARA添加到最终浓度为0.2％，诱导其余19 mL培养物中的OCR表达。在整个OCR诱导时间过程中，从20 mL培养物中取1 ml等分试样，并转移到含有10μl合适的放射性同位素的1.5 mL Eppendorf管。通过在1 mL培养物中添加200μl冰冷的50％三氯乙酸（TCA），在37°C下孵育8分钟后，放射性同位素掺入在37°C下停止。此外，在感应时间过程中，对1 mL等分试样进行了对OD600的测量。将最终的1.2 mL TCA培养样品加载到GF/C过滤器上（Whatman） 用5％TCA预洗，并用5 mL冰冷的TCA两次洗涤过滤器，然后将两个5毫升的滤波器与95％EtOH洗涤，然后用5 mL冰冷的TCA清除过滤器。将过滤器放在闪烁的小瓶中，并在室温下干燥2小时，然后添加5 mL的生态岩质鸡尾酒（MP BioMedicals）。摇动15分钟后，使用自动TDCR液体闪烁计数器（HIDEX）对放射性进行了定量。通过放射性计数（CPM）对OD600的放射性计数（CPM）的归一化来量化同位素合并，而预诱导零时间点用作参考（设置为100％）。所有实验均使用与不同菌落接种的三种独立的液体起动器培养物作为生物学三次认证。 　　通过使用萤火虫荧光素酶mRNA作为输入，通过在纯XPRESS中的体外蛋白质合成试剂盒（NEB）中产生荧光素酶信号来监测体外翻译。PT7-FLUC在T7启动子控制下编码萤火虫荧光素酶（FLUC）基因，用作Megascript套件（Thermo Scientific）的T7体外转录模板。mRNA用DNase I（Thermo Scientific）处理，并用Monarch PCR和DNA清理套件（NEB）纯化。根据制造商的说明，将Pure Xpress的体外翻译反应在无RNase管中组装，并进行了较小的修改。将反应混合物调节至总体积为5μl（2μl溶液A，1.5μL溶液B，0.3μlRibolock（40Uμl -1，Thermo Scientific）和0.2μL-卢糖蛋白（10 mm，SigMA，Sigma）），并补充了0.5μl的浓度，将其补充为0.5μl -lib octrated Arib orib或Arib Arib（E26A）（E26A）（E26A）或相同体积的缓冲液A（50 mM NaCl，1 mM EDTA，100 mM Tris-HCl和5 mMβ-ME，pH 8.0）作为对照。反应是通过添加0.5μl纯化的FLUC mRNA（500 ng）开始的，该反应立即放置在384孔的白色板中，并覆盖有光学清晰的膜。在37°C下，用Enspire多模板读取器（Perkinelmer）测量发光信号的积累3小时。用量子蛋白宽范围测定试剂盒（Invitrogen）确定ARIB浓度。 　　为了选择巴黎 - 埃斯卡普突变体，将噬菌体T5mos与巴黎+（PFR85）培养物连续孵育3天。简而言之，在达到OD600 0.6后，将细胞以大约0.1的MOI感染T5MOS，培养物在37°C下孵育过夜。第二天收集噬菌体，并使用1毫升裂解物来开始使用新鲜巴黎+（PFR85）培养的下一轮感染。从从巴黎+（PFR85）培养物获得的单个斑块中纯化Escaper突变体，并在巴黎（PFR66）培养物上产生。将八个毫升的高尊裂液（每毫升约1010个斑块形成单位）固定在PEG中，并如前所述纯化了噬菌体基因组DNA 58。DNA库是根据标准方案制备的，并在Miniseq平台（Illumina）上进行了对配对端150个周期（75+75）的测序。基因组组件是用在Unicycler59中实现的黑桃进行的。为了鉴定突变，将T5MOS逃生剂的基因组与初始库存的T5MOS和T5WT的测序基因组对齐。Glukhov等人报告的T5菌株在DNBSEQ-G400平台（BGI）上进行了测序，以验证缺失边界。 　　从携带PFR85（PTET ARIAB）或对照质粒PFR66（PTET SFGFP）的大肠杆菌菌株MG1655中分离总RNA。细胞还与OCR一起携带PFD250（PPHLF OCR），并在可诱导的DAPG PPHLF启动子的控制下（图5G和扩展数据图8B），以及质粒PFD287，载有噬菌体T5的质粒在Arabad启动子诱导的噬菌体T5的trnalys（图5H）中（图5H）。 　　将细胞在LB中以1：100稀释，并从过夜培养物中适当的抗生素稀释，并在37°C下搅拌生长。当培养物达到OD600 0.2时，将ATC添加到0.5 µg ml -1的最终浓度中，以诱导巴黎系统的表达。对于图5H中所示的实验，将-ARA添加到0.2％的最终浓度中，以诱导质粒PFD287的T5 Trnalys。生长持续至OD600 0.4，并将OCR触发诱导，DAPG添加到50 µM的最终浓度，然后在诱导后再孵育15和30分钟。 　　将细胞以4,000克离心10分钟，重悬于0.2 mL的溶菌酶缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0、2 mM EDTA，1％Triton X-100和20 mg ML-1溶菌酶），并在37°C下裂解30分钟。将一毫升的Trizol试剂（Zymo研究）添加到样品中，并在室温下孵育5分钟。用0.2 mL的冷氯仿提取裂解物，并在4°C下以12,000g离心15分钟。样品的水相用0.5 ml的100％冷异丙醇沉淀，在室温下孵育10分钟，并在4°C下以12,000克离心10分钟。用1 ml的75％乙醇洗涤RNA颗粒，在室温下干燥，并溶于50 µL无核酸酶的水。用纳米体分光光度计测量总RNA浓度，然后将样品在7 m尿素10％丙烯酰胺凝胶中分离，然后用SYBR金可视化。 　　在与提取总RNA相同的条件下，将细胞生长在20 mL培养基中。当诱导的培养物达到OD600 0.8时，将细胞以5,000克离心25分钟，在5 ml的0.9％NaCl中洗涤，并以5,000g的速度再次离心25分钟。以下是根据参考文献进行的。60。将颗粒悬浮在2 ml的50 mM乙酸钠（NAOAC）和10 mM MGOAC pH 5.0中，并添加1.9 ml商业酸性苯酚pH 4.5（Ambion）。在37°C下以200 rpm摇动所得混合物30分钟，然后在4°C下以5,000g离心15分钟。收集上水相并在0.1 m NaCl中沉淀总核酸，并补充了相等的2-丙醇，以便在室温下过夜孵育。在4°C下以14,500克离心15分钟后，用80％乙醇洗涤颗粒并用气干洗涤。 　　通过降水量从样品中去除rRNA：将颗粒悬浮在0.8 mL的1 m naCl中，在4°C下以9,500克旋转20分钟。收集上清液，与1.7 mL乙醇混合，在-20°C下孵育30分钟，然后在4°C下以14,500g离心5分钟。然后将颗粒用80％乙醇洗涤，并用气干洗涤。 　　通过降水来实现从样品中去除DNA：将颗粒重悬于0.6 mL的0.3 m NaOAC pH 5.0中。然后将混合物在60°C下加热5分钟，然后定期移液器，然后在室温下添加0.34 mL 2丙醇，并在室温下孵育10分钟。然后将溶液在室温下以14,500克离心5分钟，并收集上清液。 　　通过将0.23 mL乙醇添加到上清液中，在4°C下以14,500克离心15分钟，将所得的小RNA级分沉淀，以80％乙醇和空气浸泡5-10分钟。将颗粒溶解在0.35 mL无RNase的水中。 　　为了脱酰化，将馏分在37°C的0.1 M Tris pH 9.0中孵育45分钟。通过在-80°C下加入2.7卷，在0.3 m NaOAC pH 5.0中达到30分钟，在4°C下以16,000克离心25分钟，可以实现0.3 m的NaOAC pH 5.0。用80％乙醇洗涤颗粒，风干，溶解在80 µL柠檬酸钠中。 　　将50 nm活化的ARIB或核酸酶缺陷型ARIB（突变E26A）二聚体在37°C下与90 ng富集的小RNA孵育30分钟，如上所述，在10 µL反应混合物中含有20 mm Tris pH 8.0和200 mm nacl中提取。当添加时，MGCL2处于最终浓度为2 mm。通过添加10 µL的100％甲酰胺，然后在22 W常数下添加15％丙烯酰胺/7 m尿素降低培养基凝胶的含量，从而停止反应。使用Chemidoc MP成像系统（Bio-Rad）对SYBR金染色的凝胶进行成像。 　　为了精确地识别ARIB裂解位点，DNA探针F693（5' - /fam/tggtggtggtggtggtgtgcgtgcgtgcgtgcgtgcagtcgaAcgcctgcgacc-3'，在5'-末端携带荧光素），在5'-末端使用荧光素）用于在室温下在小rnas的反应中，该反应与无用或不含Activ的小型RNA进行了反应。在12 µL反应中，将2 µL的1 µM探针与750 ng的RNA在95°C的热块上孵育，然后将其关闭并向左冷却以冷却。接下来，将8 µL带有逆转录混合物的PCR（Superscript III RT，Invitrogen）添加到反应混合物中，并将其加载到热环体上，并在以下条件下：在25°C下5分钟，在55°C下在55°C下60分钟，在70°C下15分钟。在添加20 µL的100％甲酰胺后，将反应加载在15％丙烯酰胺/7 m尿素变性的培养基凝胶下22 W常数下运行。使用Chemidoc MP成像系统（Bio-Rad）记录荧光素信号。梯子是通过使用荧光探针F693进行扩展反应而产生的76个对应于Trnalys的基础。在以下条件下孵育的TAQ DNA聚合酶PCR混合物中进行延伸：在95°C下3分钟的5个循环（在95°C下为30 s，在66°C下为30 s，在72°C下为2分钟），然后在72°C下5分钟。 　　将ARIB切割的小RNA（750 ng）在25°C下在30 µL连接反应中与3 µL的5'连接反应缓冲液（10x），2.5 µL 5'连接酶混合物和1 µL的5'SR的5'SR适配器（no nebe nebne remultne）孵育1 h。E7300s）。A tRNALys-specific reverse transcription was then performed on 15 µl of the ligation reaction by the addition of 1.5 µl of 10 mM dNTPs, 6 µl of 5× First-Strand Buffer, 1.5 µl of 0.1 M DTT, 1.5 µl of SuperScript III RT from Invitrogen′s SuperScript III kit (no. 18080-093) and 50 pmol of the reverse转录引物（5'-TGTGCTCTTCCGATCT GGTGGGTCGTGCGTGCAGGATTCGAACCTG-3'）总体积为30 µL，在55°C下孵育1小时。使用Thermo Scientific Dreamtaq Green PCR Master Mix（2×）套件进行PCR：5'-AATGATACGGCGACCACCCACCCACCCACCACCACGTCACGTTCAGAGAGTCAGTCTACAGTCCGA-3'''and and and and and and5'-caagcagaagagaggcataCgagatGatgTgaggagtTcagAcgTgTgtgTgtcttccgatct-3'。凝胶纯化了大约120个碱基对的带，并用底漆5'-GTGACTGAGGACGTGTGTGTGTGCTCTTCCGATCT-3'发送了Sanger测序。 　　在7 M尿素10％丙烯酰胺凝胶中，在180 V时将RNA运行1小时，然后使用XCELL SURELOCK MINI-CELL系统（XCELL II印迹模块（Invitrogen））转移到尼龙膜（Invitrogen）中。然后将膜与紫外线辐射交联5分钟。用30 mL含有6×SSC（盐水柠檬酸钠缓冲液），0.5％SD和0.05％酪蛋白在45°C的30 mL预杂交后，将膜与2 nm FAM（最终浓度）（最终浓度）（6-羧基含量）（6-羧酸盐）或Irdye irdyee irdyee 800 0000或Irdye 800 irdye 80000探针（补充表3）在45°C的10 mL预杂交溶液中。最后，在室温下用2×SSC和0.1％SSC洗涤膜两次，并在60°C下用0.2×SSC和0.2×SSC洗涤10分钟，持续10分钟。使用Chemidoc MP成像系统（Bio-Rad）捕获图像。 　　大肠杆菌Trnalys（B803）和T5 Trnalys（B806）探针的序列及其与大肠杆菌和T5 Trnalys的同源性在扩展数据中显示了图11a。为了确认T5 Trnalys探针的特异性（B806），在没有T5 Trnalys的情况下，使用该探针进行RNA印迹，这表明我们的结论不可能受到该探针与E. coli Trnalys或其他TRNA的非特异性结合的影响（扩展数据图11B）。我们还可以确认，用于检测大肠杆菌trnalys的B803探针未检测到T5 Trnalys，因为在存在T5 Trnalys的情况下激活巴黎时，该探针的信号丢失了（图5H）。 　　从2022年7月开始，使用Defenseffinder v.1.1.1（参考文献61）和Defenseffinder模型V.1.2.3进行了防御系统检测。从2022年7月开始。 　　使用PFAM63数据库v.33.1和标准设置的HHPRED62 Web服务器进行了防御系统域注释。对于巴黎，使用Ariab的结构信息和ESMFOLD64结构预测来注释触发结合和盘绕线圈域。 　　从2022年7月起，Defenseffinder v.1.1.1检测到的巴黎系统用于建造系统发育树。仅保留了覆盖量超过75％的咏叹调和阿里布的命中，以避免伪基。然后使用MMSEQS2（参考文献65）v.13.45111在ARIA和ARIAB上聚类，身份阈值为80％，覆盖阈值为90％。然后使用每个集群的单一代表来构建Aria树，并使用Cognate Arib来构建Arib树。仅使用AAA15 ATPase域和ARIB树构建ARIA树，仅使用DUF4435域建造。通过HMMSearch（来自HMMER 3.3.2）在大肠杆菌B185巴黎系统上检测到域，并使用MAFFT v.7.505（参考文献66）（默认参数）进行了首次对齐，以在其他巴黎变体中提取相应的序列。使用肌肉v.5.5.1.linux64（参考文献67）使用型号Super5进行了用于制造树的最终对齐，并使用clipkit v.1.3.0与选项SEQ-GAP进行修剪。使用M5核糖酶作为外组的DUF4435树使用来自不同进化枝的选定代表性命中进行，并使用Muscle v.5.5.1.linux64与模型SUPER5对齐。所有树木均使用iqtree V.2.0.6（参考文献68,69）建造，并使用Modelfinder和Ultrafast Bootstrap 1000建造。 　　使用HMMER 3.3.2和PFAM Hidden Markov Model 33.1的HMMSEarch在先前检测到的防御系统上使用HMMSEarch进行了AAAA15/21防御系统。除了经过实验验证的同源物外，还使用了从检测结果中随机选择20种蛋白质，覆盖范围超过75％。使用MAFFT v.7.505进行ATPase对齐，并使用IQTREE v.2.0.6建造了树木，并使用Modelfinder和Ultrafast Bootstrap 1000建造。 　　图3a，b，e，f中介绍的下拉实验在两到三个生物学重复中得到了复制。图5G，I，J中介绍的实验被复制了三次，并在图5H中进行了两次。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。