抗体反馈调节SARS-COV-2 mRNA疫苗接种后的免疫记忆

　　单克隆抗体受益者组的参与者是健康的SARS-COV-2-NO自愿者，他们在纽约洛克菲勒大学医院接受了第一阶段1阶段研究，并接受了两种抗Sars-Cov-2 RBD单克抗体的单剂量（NCT04700163）。第1期临床试验具有剂量降低设计，并评估了两种单克隆抗体的安全性和耐受性以及药代动力学。单克隆抗体鸡尾酒（C144-LS和C135-LS的比例为1：1）与23个招募的个体中的21分（n = 2接收安慰剂）中施用，允许进行多次临时安全性分析。单克隆抗体以100或200 mg施用S.C.或每公斤1、5或15 mg的施用。（补充表2）。第一阶段研究的合格参与者是健康的成年人，没有SARS-COV-2感染或疫苗接种病史，或者先前接受任何SARS-COV-2治疗剂，包括其他单克隆抗体或血浆中的血浆。有关纳入和排除标准，研究设计和第1阶段研究的终点的更多详细信息，请访问ClinicalTrials.gov（NCT04700163）。在第1阶段研究中接受单克隆抗体的21个个体中，有18个在平行的观察性研究中共同入学，以评估其对随后的SARS-COV-2 mRNA疫苗接种的免疫反应。一个人选择接收Janssen（AD26.COV2.S）疫苗，另一个人（安慰剂接受者）显示出N滴度变化，然后在参加观察性研究中与最近的SARS-COV-2感染兼容，这使得它们不合格在这项研究中包含。其余的1阶段研究参与者选择不参加免疫反应的平行研究。这项观察性研究中包括的18种单克隆抗体受体接受了现代（Spikevax，mRNA-1273） 或Pfizer-Biontech（comirnatiy，Bnt162b2）mRNA疫苗针对严重的急性急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-COV-2）的WT（Wuhan-Hu-1）菌株。接种疫苗的对照组的参与者是健康的SARS-COV-2-NOIVES志愿者，他们接受了两种目前已批准的SARS-COV-2 mRNA疫苗之一，ModernA（Spikevax，mRNA-1273）或Pfizer-Biontech（Comirnaty，comirnaty，bnt162b2）。这些对照人已被招募到洛克菲勒大学医院，用于纵向评估其对SARS-COV-2 mRNA疫苗接种的免疫反应9,11。我们先前报道了从该组获得的发现，并参考参考文献。9,11有关参与者招聘，包容和排除标准以及人口特征的更多详细信息（补充表1和2）。在每次样本收集访问中，任何一组的参与者都向洛克菲勒大学血液样本收集提供，并被要求提供其疫苗接种方案的详细信息，可能的副作用，合并症和可能的Covid-19-19。在研究之外进行了疫苗接种，并由个人及其医疗保健提供者酌情遵守现有准则，因此并不受其参与我们的研究的影响。测试了SARS-COV-2的基线和纵向血浆样品的结合活性（N; Sino Biological，40588-V08B）。除了参与者报告的病史外，在研究间隔期间缺乏对N的血清转化被排除在外。使用IMEDRIS（V.11.02）的软件IRIS进行了临床数据收集和管理。所有参与者在参与研究之前均提供了书面知情同意书，该研究是根据良好的临床实践进行的。该研究是根据所有相关的道德法规进行的 洛克菲勒大学的机构审查委员会批准了与人类参与者研究的临床方案（CGA-1015和DRO-1006）。补充表1和2和参考文献中提供了详细的参与者特征。9,11。 　　如先前通过梯度离心报道，纯化了从洛克菲勒大学收集的样品获得的外周血单核细胞，并在胎儿小牛血清（FCS）和二甲基硫氧化二甲基硫氧化物的存在下储存在液氮中。将肝素化的血浆和血清样品等分为-20°C或更小。在实验之前，将血浆样品的等分试样热灭活（在56°C下持续1小时），然后在4°C下储存。 　　为了评估被动施用的抗体C144-LS和C135-LS的药代动力学特性，在输注后的1、3、6、6、9和12小时，在1、3、6、6、9和12 h的抗体给药（第0天）以及第1、3、7、14、14、14、14、21、21、21、56、56、84、126、126、126、168、168和252和33、168、168、168-和33、168、168、168和252和33、168、168和C1和252和222和222和333、168、168、168-和332和332和332和CC1和252和CC1时测量其血清抗体水平。使用串联质谱法（MS/MS）测量血清中的C135-LS水平。简而言之，使用链霉亲和素珠和生物素化的RBD蛋白从血清样品中分离出分析物。将分离的蛋白质用二硫代醇蛋白变性，用碘乙酰胺烷基化，并用胰蛋白酶消化。最终提取物使用高性能液相色谱分析，并使用阳性离子电喷雾进行柱切换和MS/MS检测。线性1/浓度加权的最小二乘回归算法用于定量。非室内分析用于估计来自C144-LS和C135-LS的血清水平的药代动力学参数。Phoenix Winnonlin（V.8.2）用于非室内分析。使用每种单克隆抗体后的实际样品时间用于估计血清药代动力学参数而不是标称时间。Half-life estimates were similar between administration routes for both C144-LS and C135-LS, indicating a half-life of 2–3 months for both monoclonal antibodies by either administration route (C144-LS: 68.9 to 99.3 days for s.c. groups and 86.9 to 92.3 days for i.v. groups; C135-LS: 72.7 to 77.9 days for s.c. groups and 70.5 toI.V. 94.7天。使用三相衰减模型在GraphPad Prism中进行了药代动力学数据的可视化。 　　C57BL/6J小鼠购自杰克逊。所有使用的小鼠都是实验开始时6-12周的女性。将小鼠的温度固定在22ºC的温度下，湿度在12 h – 12 h的光线周期下，并随意获得食物和水。使用含有5 µg重组RBD和8.5 µL 2％alhydrogel（Invivogen，21645-51-2）的25 µL的1×PBS进行脚踩免疫。用100μg每种抗体制备3BNC117/10-1074和C135/C144抗体鸡尾酒，并通过i.v中以1×PBS递送。注射。所有动物程序和实验都是在没有盲目或随机化的情况下进行的，并且根据洛克菲勒大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案。 　　ELISA分析36,37分，以评估与SARS-COV-2 WUHAN-HU-1 RBD，NTD或S结合的抗体，通过将高结合的96级 - 孔板（Corning 3690）涂覆，用1μgml-1蛋白质溶液中的磷酸盐蛋白质溶液中的含50μL涂覆50μL，在phosphate-buffeed saline（pbs）中（pbs）4°°C将板用洗涤缓冲液（1×PBS，具有0.05％Tween-20（Sigma-Aldrich））洗涤六次，并在室温下孵育170μl（1×PBS（1×PBS，其1×PBS，具有2％BSA和0.05％Tween-20（Sigma-Aldrich）））在室温下。阻塞后，立即将单克隆抗体或血浆样品添加在PBS中，并在室温下孵育1小时。在1:66开始稀释下测定血浆样品，并通过三倍或四倍稀释。单克隆抗体以10μgml -1的起始浓度和11个三倍的连续稀释液测试。将板用洗涤缓冲液洗涤六次，然后与抗辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗人IgG或IgM二级抗体（Jackson Immuno Research，109-036-088和109-035-129）在1：5,000稀释度（igmm和igg）中，在1：5,000稀释缓冲液中，杰克逊免疫研究。通过添加HRP底物，3,3'，5,5'-四甲基苯胺（Thermo Fisher Scientific）来开发板。通过添加50μl的1 M H2SO4来停止发展反应，并使用ELISA微板读取器（Fluostar Omega，BMG LabTech）在450 nm处测量吸光度，并使用Omega和Omega Mars软件进行分析。每个板上包括归一化器对照样品。对于血浆样品和单克隆抗体，分别使用四参数非线性非线性回归模型（GraphPad Prism v.9.3）计算了一半 - 最大结合滴度（BT50）和半Xmimal有效浓度（EC50），并使用以下响应：[agonist]与四个参数slope（四个参数）;底部= 0;山坡> 0; TOP =在至少3个连续稀释的步骤中，标准剂对照抗体或等离子体样品的实验特异性上平台达到饱和。将曲线拟合限制为上限，该上限与已知的归一化器控制达到的最大光密度相对应，以限制板间/经验变异性（批处理效应）。使用先前测量的IgG抗体作为归一化器对照建立了五聚体IgM BT50值。来自健康供体和同型对照单克隆抗体的流行前血浆样品用作阴性对照，如所示，用于验证5。所有报告的EC50和BT50值都是至少两个独立实验的平均值。 　　先前描述了编码SARS-COV-2（GenBank MN985325.1; S蛋白残基319-539）的RBD的哺乳动物表达载体。先前已被描述为26。根据制造商的说明（New England Biolabs（NEB），E0554S），生成了编码R346S/E484K和N440K/E484K取代的质粒。通过Sanger测序证实了所有构建体，并用于通过瞬时转染Expi293f细胞（Gibco/Thermo Fisher Scientific，A14527）来表达可溶性蛋白质。4天后收集上清液，并通过镍亲和色谱法纯化RBD蛋白。S 6P蛋白通过镍亲和力纯化，然后是尺寸排斥色谱法。使用天然凝胶电泳鉴定出来自尺寸排斥色谱的峰分数，并在4°C下汇总与单体RBD或S三聚体相对应的峰级分。 　　先前已经描述了在PSARS-COV-2-SΔ19（WUHAN-HU-1）的背景下表达SARS-COV-2 s的质粒，并且通过引入R683G替代物产生了带有干扰的FURIN裂解位点的PSARS-COV-2-SΔ19的衍生物。脂蛋白切割部位的破坏会导致颗粒感染性升高。先前已经描述了携带R683G取代的质粒表达SARS-COV-2 OMICRON BA.4/5 s。通过重叠延伸PCR介导的诱变和吉布森组装构建了两个含有C135/C144抗体逃生突变的质粒。具体而言，引入的替换如下：R346S/Q493K和R346S/N440K/E484K。重要的是，由于将这些替代物纳入PSARS-COV-2-SΔ19R683G背景中，因此将对所有突变体和变体假病毒的中和活性与WT SARS-COV-2 S序列（GenBank：NC_0455512）进行了比较，也将携带R683G（PSARS-COV-2-SΔ19R6Δ19R683G）。如先前所述5,14，生成了SARS-COV-2伪型颗粒。简而言之，将HEK293T细胞用PNL4-3δENV-NANOLUC和PSARS-COV-2-SΔ19转染，并在转染后48小时收集颗粒，过滤并存储在-80°C下。 　　来自健康供体（技术阴性对照，未显示的数据），接种疫苗的单克隆抗体受体和mRNA疫苗对照的血浆（技术阴性对照，未显示）的血浆五倍逐渐稀释的流行前阴性对照等离子体，或与SARS-COV-2-2-PSEUDYT型病毒在37°°C下为1 h孵育​​1 h。随后将混合物与HEK293T-ACE2细胞5（用于所有单克隆抗体WT中和测定）或HT1080ACE2 CL14细胞6（用于所有血浆中和分析）48 h，然后用PBS洗涤PBS，并用Luciferase Cell培养基培养物lipsy lipsy lysy Sysis 5×Geage（Prome）（PROMEGA）。使用ClarioStar多模读器（BMG，V.5.70.R3），使用纳米GLO荧光素酶测定系统（Promega）测量裂解物中的纳米荧光素酶活性。将相对发光单元标准化为在没有血浆或单克隆抗体的情况下从感染SARS-COV-2伪型病毒感染细胞的细胞中标准化。使用四参数非线性回归（最小平方柱回归方法：tops = 1，tops = 1，bottom pros = 0; In GraphPad prims in Graphpad prims），使用血浆（NT50）或半粘性浓度（IC50和IC90）的半Xmimal中和滴定（IC50和IC90）的半末端中和。 　　如前所述5。根据制造商的说明（Thermo Fisher Scientific），使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit（Thermo Fisher Scientific），使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit进行了卵蛋白（Sigma-Aldrich，A5503-1G）。将生物素基化的卵巢蛋白与链霉亲和素Bv711结合为人类的单细胞类型（BD Biosciences，563262）或链霉亲和素-BB515进行表型（BD Biosciences，564453）。对于所有人类和小鼠实验，将RBD连接到链霉亲和素PE（BD Biosciences，554061）和链霉亲和素AF647（Biolegend，405237）5,9。 　　先前描述了流式细胞仪的单细胞分选。简而言之，根据制造商的说明，使用PAN-B细胞隔离试剂盒（Miltenyi Biotec，130-101-638）使用PAN-B细胞隔离试剂盒通过阴性选择富含B细胞。在染色之前，将富集的B细胞与FCR阻滞抗体（BD，564220）在荧光激活的细胞分选（FACS）缓冲液中以1：200稀释（1×PBS，2％FC，1 mm乙基二苯甲酸二甲甲酸乙酸（EDTA））进行20分钟。随后，将细胞与以下抗人类抗体（全部为1：200稀释）在FACS缓冲液中孵育：抗CD20-Pecy7（BD Biosciences，335793），抗CD3-APC-EFLURO 780（Invitrogen47-0086-42), anti-CD16-APC-eFluor 780 (Invitrogen, 47-0168-41), anti-CD14-APC-eFluor 780 (Invitrogen, 47-0149-42) and Zombie NIR (BioL​​egend, 423105), and fluorophore-labelled RBD and ovalbumin（OVA）在冰上持续30分钟。根据制造商的说明，添加了每个样品中指示的珠子计数珠（Life Technologies，PCB100）。Single CD3−CD8−CD14−CD16−CD20+Ova−RBD–PE+RBD−AF647+ B cells were sorted into individual wells of 96-well plates containing 4 μl of lysis buffer (0.5× PBS, 10 mM dithiothreitol, 3,000 U ml−1 RNasin Ribonuclease Inhibitors (Promega,N2615）使用FACS ARIA III系统和FACSDIVA软件（Becton Dickinson）进行采集和FlowJo进行分析。稀释）：抗CD19-BV605（Biolegend，302244），抗IGG-PECF594（BD，562538），抗IGM-AF700（Biolegend，314538）和抗CD38-BV421（Biolegend，Biolegend，3035526）。 　　在FACS缓冲液（1×PBS，2％FBS，2 mM EDTA）中收集来自小鼠的popliteal淋巴结，通过35 µM滤网（Corning，352235）机械破坏并过滤。然后，细胞在冰上进行迭代的迭代循环20分钟（除非另有说明，否则将所有抗体在1：200稀释）：（1）抗小鼠CD16/32（小鼠BD FC Block，BD Biosciences，553142）;（2）荧光团偶联的RBD（见上文）；(3) anti-T and anti-B cell activation antigen-FITC (BD Biosciences, 553666), anti-CD38-PB (BioL​​egend, 102720; 1:100 dilution), anti-CD45R/B220-BV605 (BioL​​egend, 103244), anti-CD4-APC-eFluor780 (Invitrogen,47-0042-82），抗CD8A-APC-EFLUOR780（Invitrogen，47-0081-82），抗NK1.1.1-APC-EFLUOR780（Invitrogen，47-5941-82），47-5941-82），抗F4/80-APC-EAPC-EFLUOREGEN（47-5941-82）抗CD95-PE-CY7（BD Biosciences，557653）和僵尸NIR（Biolegend，423105，1：1,000）。根据制造商的说明，将相当性计数珠（Life Technologies，PCB100）添加到样品中。将单个CD4-CD8A-NK1.1-F4/80-B220+CD38-GL7+CD95+细胞在BD FACSYMPHYPHYS SYS System上分类为96孔平板，其中包含1％2-β-甲醇（Sigma-Aldrich），在TCL缓冲液中，并在Qiiagen，in Qiiagen，1031576）中排序-80°C用于RNA逆转录。 　　如先前所述鉴定并测序人类抗体5,39。简而言之，对单个细胞的RNA进行了反转录（Superscript III逆转录酶，Invitrogen，18080-044），并将cDNA储存在-20°C下，或用于随后通过嵌套的PCR和sanger sequencect进行可变的IGH，IGL和IGK基因的扩增。使用MacVector（V.17.5.4）和Geneious Prime（V.2020.1.2和V.2022.1.1）进行序列分析。第一个PCR反应的扩增子用作序列和无连接非依赖性克隆到抗体表达向量的模板。如先前所述的40,41，对小鼠单克隆抗体进行测序并从单个FACS分类的B细胞克隆，并进行以下修饰。简而言之，使用磁珠（Rnaclean XP，Beckman Coulter，A63987）纯化了96孔板中单细胞的RNA。将单细胞RNA从具有11μl的溶液中洗脱，其中含有14.4 ngμl-1的随机引物（Invitrogen，48190011），igepal Ca-630的0.5％（蒸馏液中的10％）（在蒸馏液中为10％）无核酸酶的水（Qiagen，129115），然后在65°C下孵育3分钟。通过逆转录（Superscript III逆转录酶10,000 U，Invitrogen，18080-044）合成cDNA，并在添加10μl无核酸酶水后储存在-20°C下。使用先前出版的Primers41和以下热电器条件进行退火（请参阅下面），详细信息（请参见所有72°c/55 s）和ccr ccr cycccr：prig ccr，cy1和ccr ccr cycccr：cycccr：prigy s：46°C/30 S/50循环；PCR2（IgG和IgM）：55°C/30 S/50循环；PCR2（IGK）：46°C/30 S/50循环。纯化后，对重链和轻链PCR产物进行了测序，随后使用MacVector和Geneious Prime（V.2022.1.1）进行了分析（V.2022.1.1）， 以及下面详述的生物信息学管道。如前所述41，将小鼠Ig序列排序为具有序列和独立克隆的短同源性和连接独立克隆的短同源物，并将其克隆到人IGHG1 FAB和IGLK表达矢量中，如前所述41。通过Sanger测序验证了所有质粒序列，然后所有重组单克隆抗体（人记忆B细胞衍生的全长IgG和HIS6标记的小鼠衍生的人IgG1 Fab片段）随后均被如前所述产生并纯化，如前所述。为了产生五聚体IgM，如上所述，通过测序和与无关的克隆进行测序和无连接的克隆进行克隆，只是将IGH可变基因克隆到IgμStractionVector中（Invivogen，Pfusess-HCHM3）。然后，通过用矢量瞬时转染具有编码适当的J链，轻链和重链的向量的HEK293-6E细胞的瞬时转染以1：1.5：1.5的比例表示五聚体IgM。6天后，从细胞上清液中收集分泌的IgM，并使用Poros CapturesElect IgM亲和力矩阵套件（Thermo Fisher Scientific，1952890500）进行纯化。通过尺寸排斥色谱法进一步纯化亲和力纯化的IgM。使用Amicon Ultra Ultra 100 kDa（Millipore）离心滤波器单元分析了五聚体IgM的峰值分数，并将缓冲液分解为PBS。 　　如先前所述的5,15,41进行了BLI测定，如下所示。简而言之，我们在30°C下使用了Fortebio Octet红色仪器（Fortebio数据采集软件v.11.1.3.25），并在1,000 r.p.m.上摇动。抗SARS-COV-2 RBD IgG和Fab片段的单体亲和力是通过在没有WT RBD的情况下从使用相同IgG/Fab进行的痕迹获得的信号来得出的。使用蛋白A生物传感器（Fortebio，18-5010）进行人IgG的动力学分析如下：（1）基线：在缓冲液中浸入60 s 60 s（1×八八核动力学缓冲液，Sartorius，Sartorius，18-1105）；（2）加载：浸入200 s的溶液中，在10μgml -1的IgG中浸入；（3）基线：浸入200 s的缓冲液中；（4）关联：与WT RBD浸入300 s的溶液中，三种不同的浓度范围为200至5μgml -1；（5）解离：在缓冲液中浸入600 s。使用FORTEBIO的快速1：1绑定模型和数据分析软件进行曲线拟合。平均平衡解离常数（KD）是通过平均所有与理论拟合匹配的R2值≥0.8的结合曲线来确定的。为了建立低亲和力抗体与多聚合抗原的结合，将6p稳定和生物素化的S三聚体与重组链霉亲和蛋白酶（Acrobiosystems，STN-N5116）在室温下30分钟孵育30分钟修改：与S-Multimer以430μgml-1进行关联步骤（4）。根据制造商的规程“经典三明治测定”，使用蛋白A生物传感器（Fortebio，18-5010）进行表位映射测定：（1）传感器检查：单独将传感器浸入30 s中，单独将其浸入缓冲液中（Buffer Fortebio，18-1105）;（2）捕获第一抗体：将传感器浸入10μgml -1的抗体1中浸入10分钟；（3） 基线：传感器仅在缓冲液中浸入30 s；（4）阻止：将传感器浸入20μgml -1的IgG同种型对照（3bnc117）的情况下浸入5分钟；（5）基线：仅在缓冲液中浸入30 s s；（6）抗原关联：将传感器浸入20μgml -1的RBD中5分钟；（7）基线：仅在缓冲液中浸入30秒钟。（8）抗体B2：在10μgml -1的抗体2中浸入5分钟。使用相同的步骤和八位级红色仪器（Fortebio）设置与人类记忆衍生的全长IgG抗体（请参见上文），使用相同的步骤和八位级红色仪器（FORTEBIO）进行亲和力测试，并使用以下修改：单核fab片段在50μgMl-1上捕获了2g-in-fabiust on 2g biosOsors（STEP）。在步骤4中以30至120μgml -1的浓度添加单价RBD。具有可测量亲和力的结合Fab片段定义为具有生物学上可行的关联和解离动力学，即在步骤2中与生物传感器上的饱和度相关联，并显示出可辨认的a和Anterabiriage and Anciried of Annigiation（4）（4）（4）（4）（4）与R2值≥0.75相匹配的理论拟合。在测试的浓度下未在生物传感器上捕获饱和的FAB片段的亲和力无法解决，并且被排除在进一步分析之外（补充表6中为N/D）。在所有情况下，使用Fortebio Octet数据分析软件（Fortebio数据分析HT V.11.1.3.50）进行曲线拟合。 　　根据质量对抗体序列进行修剪，并使用Igblastn v.1.14与IMGT域描述系统进行注释。使用Change-O Toolkit（V.0.4.540）42系统地进行注释。重链和轻链的克隆性是使用deconeclones.py确定的。脚本计算数据集中的每个序列与其最近的邻居之间的锤击距离。随后将距离标准化以说明结序长度的差异，并根据0.15的截止阈值确定克隆性。随后将源自同一单元的重链和光链配对，并使用自定义R和Perl脚本根据其V和J基因分配了clonotypes。所有脚本和用于处理抗体序列的数据均可在GitHub（https://github.com/stratust/igpipeline/tree/igpipeline/igpipeline2_timepoint_v2）上公开获得。该研究中抗SARS-COV-2抗体中人V基因的频率分布（扩展数据图4F – H）与参考文献中产生的131,284,220 IGH和IGL序列进行了比较。43并从CAB-REP44下载 - 人类共享BCR clonotypes的数据库（https://cab-rep.c2b2.columbia.edu/）。基于108个不同的V基因，该基因构成了本研究中描述的个体的417个分析序列的分析序列（353个序列隔离序列5单克隆抗体受体和65个从9个疫苗接种的对照个体中分离出来的IgM序列（有关与对照组隔离的IgG序列，请参见RefS，参见9,11），11,11），11,11，，11，11，，，，，，，地。 我们从数据库中选择了IGH和IGL序列，这些序列由相同的V基因部分编码，并根据常数区域进行计数。扩展数据中显示的频率图4F – H相对于分析的源和同种型。我们使用双面二项式测试来检查曲目中属于特定IGHV或IgLV基因的序列的数量是否根据数据库中同一IGV基因的频率有所不同。使用纠正措施计算了调整后的P值。星号表示显着差异。使用自定义R和PERL脚本确定核苷酸体细胞突变和互补性确定区域（CDR3）长度。为了定量体细胞突变，使用iGblastn将IGHV和IgLV核苷酸序列与最接近的细菌对齐，并且差异被认为是核苷酸突变的数量。 　　数字在2022年的Adobe Illustrator中排列。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。