相对价值决定的升到阈值过程

　　除非另有说明，否则在25°C的标准玉米面培养基上饲养苍蝇（D. melanogaster）在标准的玉米面培养基上饲养，除非另有说明，否则环境湿度和12/12 h的光/暗周期。每个实验的基因型和条件分别在补充表1和2中描述。补充表1还列出了每个基因型的来源。 　　我们设计了一个新的室，用于将鸡蛋放在自由行走的苍蝇中，这使它们始终在琼脂糖上保持在塔西倒下的姿势中。苍蝇无法在这个房间里倾斜身体，因此他们无法在侧壁或天花板上行走。该约束意味着苍蝇的身体始终处于与成像平面平行的相同的一般方向上，从而使姿势参数的定量测量更加直接，并具有单个相机视图。 　　腔室是通过夹层和丙烯酸和三维（3D）打印塑料的紧密拧紧层制成的，然后安装了玻璃天花板（扩展数据图1A）。丙烯酸层是激光切割（VLS6.60，通用激光系统）。使用Visijet M3晶体塑料材料（ProJet 3510 HD Plus，3D系统）进行侧壁层。用sigmacote（sigma-aldrich）处理玻璃，使其对苍蝇的塔西（Tarsi）的湿滑 - 预防在天花板上行走46。大约十个用途后，玻璃用sigmacote撤退。3D打印的垫片层结合了一个倾斜的边缘，该边缘通过防止进入腔室侧面的侧面使苍蝇完全平行于成像平面（扩展数据图1A）。倾斜的天花板设计的灵感来自倾斜的塑料室46。倾斜的地板确实可以使苍蝇倾斜，因此不适合我们的应用。 　　腔室被多次使用，并在每次使用前洗涤。它们仅与两个底层组装在一起，然后在4°C冷却。含有1％琼脂糖（Seakem le Agarose，Lonza），0.8％乙酸和1.6％乙醇的新鲜底物被移走，以在每次测定前5小时左右完全填充井。仅用组装的两个底层仔细移液对于形成平坦的琼脂糖层至关重要 - 预防半月板的形成，这将使苍蝇倾斜。包括乙酸和乙醇以帮助模拟腐烂的水果并通常促进卵子铺设7。凝固琼脂糖溶液（约1小时）后，将腔室完全组装在一起，减去玻璃天花板，并在室温下平衡。 　　女性在日食的日子分开，并安置在小瓶中的群体。在3至6天的时候，大约20名女性在一个空瓶中，用湿的酵母糊和一个带有2毫升水浸泡的金属酱（金伯利 - 卡拉克）暴露于大约20个广州男性。将湿酵母糊剂涂在瓶子的侧面，包括1 g干酵母（Fleischmann's）和1.5毫升的4.25毫米presscine perrescine二羟基氯化物。这种治疗使女性可以交配并导致她们积聚许多卵。用酵母菌7,47或putinicine48喂食的苍蝇增加了它们产生的卵数。这些卵在治疗期间被果蝇保留，因为它们缺乏卵子沉积的柔软培养基7。大约24小时后，在温和的冷麻醉下将单个妊娠雌性放入腔室中，通常在30 s内从中恢复。因为我们只有一个用于这些高分辨率实验的成像设置（请参见下文），而飞行的倾斜度的能力对其大小的确切琼脂糖水平敏感，因此在独立的腔室中加载了多个苍蝇（图1A的扩展数据）（图1A），并且在40个sherouds和24°c中选择了几个小时的倾斜能力来进行几个小时的tilt tilt tilt tilt tilt tilt的能力。 　　为了对苍蝇体内的卵进行成像，470 nm的LED（PE-100，滚动）双过滤波（光密度（OD）4 475 nm和OD 4 500 nm短通，edumund Optics）在30 µW mm – 1时提供了激发光。首次通过琼脂糖底物后，这种激发灯从下方飞出。使用HCIMAGE软件（Hamamatsu）在10帧S – 1（FPS）中录制视频，并使用配备15.5-20.4 mm Varifocal镜头（Computar）和两个510 Nm长的备案备件（Chorma）的ORCA融合C14440-20UP摄像头（Hamamatsu）录制视频。我们使用GCAMP3，而不是最近的GCAMP变体来对卵进行成像，因为与传统的UAS49相比，在女性种系中，UASP驱动的GCAMP3转基因在先前的研究15中构建，并且在不需要产生新的转基因飞行的情况下使用。 　　为了对身体姿势进行成像，850 nm的LED通过白色丙烯酸扩散器（果蝇1 µW mm – 2）从上方照亮了竞技场。使用FlyCapture软件（FLIR）和配备有15.5-20.4毫米Varifocal镜头和780 nm Long Pass Filter（Midopt）的GS3-U3-41C6NIR-C Grasshopper摄像头（FLIR）记录视频。DeepLabcut50用于离线跟踪身体部位，包括颈部和卵形剂。通过识别迭代I中较差的框架，并将其添加到迭代I+1的训练数据集中，迭代的模型通过识别较差的框架进行了微调。总共手动注释了1,568个训练框架。如果（1）概率得分小于0.95或（2）（2）在连续框架中，则概率得分小于0.95或（2），深闭合输出坐标通过将坐标设置为非数字（NAN）过滤（NAN）。排卵开始是手动注释，是腹部似乎开始伸长过程的第一帧。搜索开始是手动注释，是排卵后腹部恢复稳定中性姿势的第一帧。腹部弯曲完成是手动注释的，作为弯曲弯曲的鸡蛋完成的框架（腹部最大偏转）。鉴定完成腹部弯曲的框架要比试图识别何时开始腹部弯曲的框架要容易得多。请注意，尽管苍蝇将腹部弯曲成卵子，但由于其他原因，它们也会弯曲腹部。苍蝇可能弯曲其腹部的一些非卵形相关的原因包括脱水，修饰和对底物采样，并在卵皮附近使用感觉器官进行脱糖。经常在计算机算法的帮助下手动注释“沉积的鸡蛋”。简要地， 我们的计算机代码发现了一组像素组，其强度在视频中的特定框架上发生了稳定变化。来自代码的输出框架数指向卵子沉积近端的实验者，并手动调整了鸡蛋沉积的确切框架。还经过实验者仔细检查了视频，以识别代码错过的鸡蛋。该代码明显加速了手动注释，对于高通量的卵子选择室特别有用，在那里注释了数千个鸡蛋（见下文）。一半可见的鸡蛋（从产卵器中出现）的第一帧被注释为鸡蛋沉积的框架。 　　我们设计了一个新的室，用于研究具有高通量的卵子选择行为。该腔室确保苍蝇几乎总是与琼脂糖卵衬底底物接触。苍蝇站立的底物可以通过其Y位置和方向明确定义。在以前的卵子选择研究8,51,52中，苍蝇可以在侧壁或天花板上行走，但在跟踪过程中被分配给其下面的底物，这很难确定以前的底物经验如何影响产生鸡蛋的决定。 　　通过夹层和紧密拧紧丙烯酸或Delrin塑料的层拧紧，然后固定玻璃天花板（扩展数据图1B）制成。丙烯酸和Delrin塑料是激光切割，并用乙状结肠处理玻璃。 　　腔室被多次使用，并在每次使用前洗涤。它们是在没有玻璃天花板的情况下组装的，并在4°C冷却。将新鲜的底物（1 mL，含1％琼脂糖，0.8％乙酸和1.6％乙醇）移入以填充丙烯酸孔，并在每次测定前约5小时内用Delrin塑料垫片形成半月板。弯月板确保苍蝇不能直接在腔室的侧面（Delrin塑料）行走，并受到塑料室的启发，并带有倾斜的地板46。无法对身体姿势进行定量测量，因为苍蝇可以通过弯月面走来倾斜。补充含蔗糖的底物的适当量的蔗糖。乙酸和乙醇均匀分布在所有底物中。凝固琼脂糖溶液（约1小时）后，在室温下对腔室进行平衡。 　　这些卵形室和测定方案的专门设计以最大程度地减少以下混杂：（1）基板之间的扩散；（2）视觉地标；（3）飞行沟通；（4）嗅觉地标；（5）温度和湿度波动；（6）饲养的变异性。通过在底物岛之间的宽度为2.5 mm的屏障和在4°C下将琼脂糖加载，从而最小化扩散。通过在近乎完整的黑暗中进行测定来最大程度地减少视觉提示。从下面提供了850 nm的照明，该照明没有可测量的灵敏度为53,54,55，用于跟踪（在苍蝇下方的琼脂糖下为1 µW mm – 2）。通过在由不透明的Delrin塑料垫片分离的孤立腔室中测定单个苍蝇，可以最大程度地减少飞行的通信。使用非挥发性化合物蔗糖作为唯一变化的变量，将嗅觉地标最小化。通过在环境室（24°C，湿度为40–60％）进行实验，保持温度和湿度保持恒定。每个屏障中的四个小通风孔使空气交换成为可能。通过控制年龄，交配状态，食物历史和昼夜节时间，养空饲养的变异性可降至最低。 　　女性和男性在eClosion的日子和小瓶中分离。在Zeitgeber Time（ZT）6（即灯后6小时）的3-6天时，大约20位女性在一个空瓶中暴露于大约20个Canton-S男性，只有一个湿酵母糊和浸入2毫升水的Kimwipe。在这些实验中，未添加到酵母酱中腐烂。第二天，ZT 8，在温和的冷麻醉下，将单个女性放入卵子腔室中。Videos were acquired at 2 fps using FlyCapture software with either a FMVU-03MTM-CS Firefly or FL3-U3-13Y3M-C Flea3 camera (FLIR) equipped with either a LM12HC (Kowa), HF12.5SA-1 (Fujinon) or CF12.5HA-1 (Fujinon) lens and a 780 nm longpass filter.使用CTRAX56在离线确定每只苍蝇的X –y位置和方向。我们将蝇蝇分配给底物，具体取决于其质心在丙烯酸屏障的中线上方还是低于底物。这种简化是合适的，因为大约2.5毫米的丙烯酸屏障实际上可以阻止飞行同时站在两个基材上，而广州S的飞行仅花费1.5％的时间在所有Tarsi都可能处于障碍物上的方向上。请注意，果蝇不会在塑料屏障（或本研究中使用的任何塑料）上产卵，因为它太难了。如上一节所述，通常在计算机算法的帮助下手动注释卵子沉积。一半可见的鸡蛋（从产卵器中出现）的第一帧被注释为鸡蛋沉积的框架。单个人类注释或跨多个人类注释者的注释可重现为±四帧或±2 s。 　　对于Kir2.1*或Kir2.1* Mut实验，我们在发育过程中表达了所有细胞（带微管蛋白启动子）57中的GAL80TS转基因，以最大程度地减少Kir Transgeres几天的转录，然后在分析卵子降压行为之前。在18°C时，GAL80TS掩盖了GAL4的转录激活结构域，从而防止了GAL4-UAS控制的转基因的转录。我们可以通过在卵形测定之前将苍蝇的温度升高约1天，从而消除KIR表达的GAL80块。具体而言，对于这些实验：（1）在18°C下饲养苍蝇；（2）在ZT 6时，将flies移至31°C，以诱导Kir2.1*或Kir2.1* mut Transgene表达；（3）第二天在ZT 5（23小时）时，将苍蝇返回至18°C。在24°C下在ZT 8下进行卵子测定。对于图5i中的一组控件，果蝇未移至31°C，而是将其保持在18°C。 　　对于GTACR1（参考文献24,58）实验，将苍蝇从鸡蛋到成年的低白光（约3 nw mm – 2）保持在低白光下。在ZT 6时，大约5-6天，大约十个女性在一个空瓶中暴露于大约十个Canton-s男性，只有湿酵母糊，而Kimwipe则浸泡了2毫升的200 µm全翻盖式全肠中（也保持在低白光下）。将湿酵母糊剂涂在瓶子的侧面，并包含1 g干酵母，在水中全移镜1.5 ml。第二天在ZT 8进行了卵子测定。从上方提供了光（567 nm）（飞行29 µW mm – 2； Rebel Tri Star LED，LuxeonStarleds）。基因型的对照是实验性蝇的兄弟姐妹，除了从上方提供未提供光线外，这些果蝇的治疗相同。光的控件是用空裂缝（空-SS）或空-Gal4驱动器的“表达” GTACR1的苍蝇。强度的两倍（57 µW mm – 2）的光对光进行的其他控制提供了额外的保证，即单独的光不能阻止产卵（数据未显示）。 　　我们偶然发现Kir2.1*25（基于基因的小鼠序列，请参见下文）比传统上在蝇中使用的人Kir2.1更轻轻地使Ovidns超极化23,59,60（图5C与图5A）。匹配的控制通道Kir2.1*mut25不进行离子并启用了遗传背景匹配的比较。最近，在FLIES61中使用了使用Kir2.1与非导向对照配对的类似策略，尽管该基因的人类变体。 　　Kir2.1*和Kir2.1* Mut序列是从小鼠先前的一项研究中获取的25。简而言之，Kir2.1*和Kir2.1*mut被修饰的野生型鼠标Kir2.1通道（KCNJ2） - 具有两个突变（Kir2.1*：E224G，Y242F）或五个突变（Kir2.1*MUT：E224G：E224G，Y242F，G1444a，Y145A，G145A，G146A，G1446A，G144A，Y146A，G144A，G144A，G144A，G144A，G1446A）。两个转基因在其C末端融合了T2A序列与TDTOMATO。为了将这些结构移植到果蝇中，将它们插入了PJFRC81的XBA1和NOT1位置（参考文献62），并通过φC31积分酶介导的转基因（转基因飞行线产生了bestgene）。Kir2.1*和Kir2.1* Mut转基因在蛋白质序列上有所不同，可能是其他方式（例如转录和翻译），从传统上用于超极化神经元的野生型人Kir2.1（KCNJ2）从蝇中超极化的神经元23,59,60。以前表达传统人类Kir2.1（参考文献63,64）转基因的中央大脑和视觉系统神经元的体内蝇电生理学表现出的超极化大于此处观察到的Kir2.1*的大约14 mV超极化（图5D）。 　　因为我们在高通量选择室中没有可量化的腹部视图（扩展数据图1b，c），所以我们使用运动速度作为搜索发作的代理（扩展数据图1D – F）和卵子沉积作为腹部弯曲的代理来产生卵（图1C）。搜索期的结束是卵子沉积的注释力矩（而不是腹部弯曲以产卵）。对于每个鸡蛋，搜索期的开始是通过在鸡蛋沉积之前用18.5 S盒车滤波器平滑卵子的迹线来确定的，并识别平滑信号下降到0.1 mm S – 1以下的第一个框架。由于棚车过滤器的长度，最小搜索持续时间为9 s。在经验上建立了这些参数，以产生与专家人类注释者在数据的可视化分析中强调的搜索发作时间。 　　卵衬速随时间的函数（图3F – H）计算如下。在执行任何计算之前，我们合并了从特定腔室类型测试的所有苍蝇获得的数据。首先，我们在x轴上的每一次bin进行迭代，对于每个垃圾箱，我们计算了分配给该垃圾箱的鸡蛋沉积事件的数量，称为#EGGS（bin）。接下来，我们在同一时间重复迭代，并在搜索期间将果蝇分配给该时间垃圾的视频帧数量，其中苍蝇被分配给该时间bin，称为#frames（bin）。最后，我们在同一时间进行了另一次迭代，并记录了在鸡蛋搜索期间，蝇的数量更改为#visits（bin）的垃圾（也就是说，如果苍蝇仍将苍蝇保留在一个特定的时间箱中，我们不会继续增加“访问”计数器。 　　为了确定平均卵子速率，我们为每个垃圾箱计算了＃鸡蛋/＃帧。由于视频以2 Hz的速度记录，因此我们将每个垃圾箱获得的值乘以120，以将其转换为鸡蛋Min -1的单位。为了确定每个垃圾箱的置信区间，我们使用了Clopper -Pearson方法（也称为“精确”二项式置信区间）来计算＃eggs/＃访问的90％置信区间。然后，我们通过将其乘以120×＃visits/＃框架将每个垃圾箱的置信区间转换为鸡蛋最小– 1的单位。置信区间不能直接从＃鸡蛋/＃帧中计算出来，因为它将取决于视频帧速率。 　　对于这些速率曲线计算，将持续时间较短的搜索期设置为30 s。这阻止了非常简短的搜索期引入速率函数的波动（通过对分子造成贡献，而不会对分母做出太大贡献）。通过这样做，速率曲线在重复或条件之间表现出更少的变化。请注意，搜索期的最小持续时间为9 s，这是由搜索期计算（方法）自动确定的。更改搜索期的定义或没有最小搜索持续时间，不会改变我们从这些曲线中的结论20。此外，使用不同的X轴箱在定性上产生相似的结果，并且不会改变我们所陈述的结论。速率功能从过渡后的速率低，至少部分部分，因为果蝇不会在基板之间的塑性屏障上产卵（扩展数据图7E，F），并且由于从定义上讲，苍蝇是在过渡过程中行走（不暂停地沉积卵）的卵（扩展数据图7G）。 　　我们设计了一个车轮，在上面行走了系绳果蝇，并在基于琼脂糖的卵子衬底上产卵。优化了设计，以最大程度地提高苍蝇产卵和旋转车轮的能力。 　　使用ProJet 3510 HD Plus 3D打印机从Visijet M3 Crystal塑料打印3D（扩展数据图2A）。一个枢轴（N-1D，瑞士珠宝）通过中心孔压制，没有被移除。每次使用前洗涤车轮。有三口井可用于加载相同或不同的基于琼脂糖的底物。每个井都被1毫米屏障隔开。车轮装有新鲜的琼脂糖底物（作为自由选择室制备）使用3D打印的琼脂糖注射模具（Visijet M3晶体材料），该模具在冰上冷却（扩展数据图2B）。在加载之前，将食用色素（Hy-Top各种食物着色）以1：10,000的稀释液稀释到1：10,000中，以便将车轮质量可视化。将井之间任何混合的车轮都丢弃了。该浓度或粘膜M3晶体材料的存在为2.5倍，并不影响自由行为控制实验的选择（扩展数据图2D）。琼脂糖的凝固后，将车轮和枢轴悬挂在两个弹簧载荷轴承（VS-30，瑞士珠宝）之间，并将其螺纹拧入透明的丙烯酸中，将其压入3D打印的底座（UMA-90材料（UMA-90材料）印刷在碳DLS，Protolabs上）（protendended数据图2C）。该轮组件存储在自定义的加湿室中，以防止琼脂糖的薄层干燥，并使车轮平衡至室温。在制备后2小时内使用了轮子。准备就绪后，将车轮组件固定在一个位于显微镜物镜下的小型定制加湿室（大约90％的湿度）中。这项研究中使用的轮子组合的重量为87.9±0.3 mg（平均值±s.d。），没有琼脂糖，琼脂糖的重量为146.4±0.8 mg。作为参考，单个妊娠雌性重约1.4 mg，而典型的泡沫球则用于飞行实验65，66重40–46毫克。车轮的大部分重量是由于琼脂糖和井中所需的井造成的。在自由行为的测定中筛选了各种更轻和合成的材料，较轻的蒸发材料不容易蒸发，但是在所有这些测定中都抑制了鸡蛋的产物。 　　使用两台CM3-U3-13Y3M变色龙相机（从侧面）和一个FMVU-03MTM-CS Firefly摄像头（FLIR）观看苍蝇，并使用FlyCapture软件捕获视频。两个850 nm的LED从左前和右前，以5 µW mm – 2的速度照亮了苍蝇。摄像机配备了15.5–20.4毫米的Varifocal镜头，以及900 nm的短通（Thorlabs）或875 nm短通（Edmund Optics）过滤器，以抑制925 nm两光子激发光的可见性。相机的暴露时间为16 ms，并使用25 fps（Arduino uno，arduino）的单个外部触发源同步触发。侧面摄像头记录了苍蝇，并在车轮上涂了一个点。该点在车轮上的一致位置上绘制，该位置是由压花的3D打印功能定义的。使用DeepLabcut（1,109个训练框架，训练和过滤，如自由行为Deeplabcut模型）对该点进行跟踪。通过将所有点位置的集合到一个圆上，然后为每个帧计算一个车轮角，将点位置转换为车轮度。苍蝇的质心横跨点的单个框架用于将车轮角转换为苍蝇在车轮上的位置。这种比对始终意味着在检测到的底物过渡期间，苍蝇的脖子位于塑料之间的隔板边界上。第二个面向侧面的摄像头用于苍蝇身体的特写视图。DeepLabcut用于跟踪身体部位，包括颈部，卵形剂和长鼻的尖端（2,259架训练框，训练和过滤，如自由行为的Deeplabcut模型中的训练和过滤）。通过在每个框架中减去颈部和卵形器的X配位，然后除以每个记录值的中值来计算归一化的长度（图1i）。自由行为的中值长度约为2.35毫米（扩展数据图1E – H）， 尽管我们没有在方向盘上测量该值。我们使用了这种归一化的度量度量，因为它可以量化伸长和弯曲的腹部，并且类似于在自由行为中测得的颈部 - 伏植物长度。尽管与自由行为长度相似，但我们平均注意到，腹部弯曲的特征略有差异（与图1L相比，图1G的扩展数据可能是由于车轮的曲率。身体角（°）是颈部和产卵剂之间的角度（图1i）。较大的角度表明腹部更弯曲。尽管苍蝇必须弯曲其腹部以产卵，但身体角度的生理相关挠度的大小（如以度为单位）并不大（图1i）。通过确定每个框架中长鼻和颈部之间的欧几里得距离，然后除以每个记录的值中位数来计算“归一化颈部至长鼻长度”。这低估了长鼻的真实挠度，因为长鼻的颈部没有开始。脖子被用作起源点，因为强大的跟踪很容易。使用前置摄像头来对齐车轮宽度中心的苍蝇。由于束缚的微小差异，身体姿势在苍蝇之间略有不同。为了实现卵的铺设，将苍蝇定位在车轮圆周上的一个点，以及距车轮的垂直距离处，当腹部弯曲时，在腹部弯曲的同时仍允许苍蝇沿方向盘上行走时，将蝇的垂直接触最大化。在某些情况下，必须将苍蝇放在靠近车轮的位置，不幸的是，这会减少腹部弯曲的动态范围。总共成像了104蝇，以收集图1H中所示的数据。大多数苍蝇没有产卵，因为除其他考虑因素外，通常需要几个小时才能开始产卵（即使是自由行为）。我们无法方便地图像 持续18小时，等待离合器开始。 　　通过检查行为视频手动注释不同行为的矩（如图1H和扩展数据图2G），同时对任何神经信号（∆F/f）视而不见。排卵开始被定义为腹部似乎开始伸长过程的第一个框架。“最长的腹部”是腹部最大伸展的框架。“腹部紧缩起步”是腹部假定稳定位置的第一个框架。搜索开始被定义为排卵后腹部恢复稳定中性姿势的第一帧。腹部弯曲的完整定义为卵子卵完整之前的第一个弯曲的框架（腹部最大偏转）；沉积的卵被定义为可见一半卵的框架。“清洁卵皮剂”被定义为卵子下卵后的第一个腹部弯曲的框架。 　　对于CSCHRIMSON18光遗传学实验，一个660 nm的LED与1毫米宽的纤维光线电缆（M660F1和M35L01，Thorlabs）耦合到使用镜头集（MAP10100100100-A，Thorlabs）。该波长位于苍蝇视觉系统灵敏度的尾端53,54,55，有助于最大程度地减少与光相关的混杂。两个LongPass过滤器（OD 4 550 nm和OD 4 575 nm（Edmund Optics））最小化LED光进入两光子检测器路径的能力，该探测器路径收集了GCAMP信号。将LED的入射区域调整为足够的宽度（直径约3毫米），以覆盖整个苍蝇的正面，从粘贴到定制持有人的头部到tarsi的尖端（参见图2F图2F表示代表性的苍蝇定位），以使所有Cschrimson-cschrimson表达Ovidn Cell cell the neurites和Neurites均可刺激着大脑的刺激。表达Cschrimson的OVIDN神经突和腹神经节中的突触（位于胸腔）也可能受到刺激 - 由于头部，长鼻和前Tarsi的障碍物，由于蝇头的整个前部和身体的整个前部受到了障碍，但其程度较小。通过调整被送入LED驱动器（T-Cube，Thorlabs）的490 Hz PWM信号（Arduino Uno，Arduino）的占空比来控制LED强度。图2A -E的Cschrimson刺激强度为641 µW mm – 2。对于图2f – h和扩展数据图6a – f，强度为641、159、148和136 µW mm2。对于扩展数据中的延长，逐渐的Cschrimson实验，将来自三个单独的刺激范式的数据组合在一起：在100 ms ON，400 ms折扣时应用159 µW mm – 2（1），持续30 s；（2）在100毫秒ON，900毫秒左右，39 s；或（3）50毫秒ON，950毫秒左右，持续50 s。扩展数据中显示的样品痕迹图5O均来自刺激范式（3）。对于扩展数据图6L – P，强度约为148 µW mm – 2。 　　雌性和雄性在叶子的日子里收集，并将组安装在标准的玉米面培养基中，并补充了2.5 mm presscine二羟基氯化物和湿酵母糊。将湿酵母糊用在小瓶的侧面，包括1 g干酵母和1.5 ml的4.25 mm腐霉菌二氯化二盐酸盐。在5-6天左右，雌性由于幼虫占据了玉米面培养基而被妊娠，而且没有额外的鸡蛋空间。这种治疗方法比自由选择实验中使用的处理更方便，并受到两项研究的单独方面的启发8,48。自由行为的控制表明，这种治疗方法增加了苍蝇下产卵的数量而不会影响选择行为（扩展数据图2E）。 　　对于Cschrimson的光遗传学实验，将苍蝇如上所述处理，但在低白光下（约3 nw mm – 2在660 nm处测量），从鸡蛋到成年。在5至6天左右的时候，大约有20名女性在一个空的瓶子里暴露于大约20个广州男性，其中只有湿酵母糊，而在水中浸泡了2毫升的200 µm全递镜（也保持在低白光下）。将湿酵母糊涂在瓶子的侧面，并包含1 g干酵母，1.5毫升4.25毫米腐烂的二盐酸盐和200 µm全移植水中的湿酵母。大约24小时后，苍蝇被束缚。Cschrimson控制实验的蝇总是与表达Cschrimson的苍蝇相同的治疗。 　　将苍蝇在大约4°C下进行麻醉，并将其束缚在自定义的持有器上67，除非导致苍蝇的金字塔的后壁以一定角度倾斜，而不是在90°的角度上升，以使大脑的更多光线达到目标66（图1d）。在束缚期间将头向前倾斜，以提供Ovidn细胞体的视图。对于电生理学，将头部更深地插入固定器中，以使其无障碍地进入带有电极的Ovidns。将苍蝇用蓝光粘合胶（键）连接到支架上。长鼻的长孔被轻轻延伸，背形音阶粘在头囊上。这阻止了与长鼻延伸相关的大脑运动，但仍允许测量长鼻的延伸（尽管动态范围比天然长鼻延伸较小）。将细胞外盐水溶液添加到持有人井中（浴），并用30口径针（BD PrecisionGlide）在角质层中切一个窗户。用镊子去除角质层和一些气管，以暴露大脑的后部。在一个小的自定义加湿室内的卵形轮上方用磁铁稳定了磁铁。 　　Extracellular saline68 comprised 103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM N-Tris(hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid, 10 mM trehalose, 10 mM glu​​cose, 2 mM sucrose, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 1.5 mM CaCl2 and 4 mM MgCl2.当用95％O2/5％CO2冒泡时，渗透压为280±5 MOSM，pH值为7.3-7.4。浴缸的温度通过将新鲜盐水流到浆中的毛皮器装置（Warner Instruments）的反馈（Warner Instruments）中，将浴室的温度设置为17–22°C。 　　我们使用了具有可移动目标（Ultima IV，Bruker）和自定义阶段（Thorlabs，siskiyou）的两光子显微镜。显微镜由Prairie View软件（Bruker）控制，并由黑色裹尸布封闭。Chameleon Ultra II TI：由715 nm Longpass滤波器（Semrock）过滤的蓝宝石飞秒脉冲激光器（相干）提供了925 nm两光蛋白激发。通过×16/0.80数值孔径（Na）物镜（×16 W CFI75 LWD，尼康）收集来自大脑的发射光，由565 nm二分色素分开，并用490-560 nm带通滤波器（Chroma）过滤，然后输入GAASP检测器（HamAmaMatsu）。对于Cschrimson光遗传学实验，通过525 nm二分性能将发射光分开，并被490–510 nm和480–520 nm带通滤波器（Chroma）滤波，以防止光遗传学刺激光进入检测器。使用压电电动机进行体积扫描。 　　在OVIDN动力学的实验过程中，使用了一系列的光学变焦，Z板板数，Z板块分离，视场，激光幂（样品为6-30 MW）和帧速率（平均1.5 Hz）。通过眼睛检查各个数据迹线，报告的结果对所使用的参数范围很强。所有记录都在细胞体内，上方和下方都有多个Z线，允许对记录进行有效定量记录，并在记录的数小时内略有Z-Drift。例如，在图1g中，以3 µm步长以14个Z键为单位，其中只有5或6个包括OVIDNB细胞体的荧光。每个记录的长度（平均75分钟）的长度因（1）苍蝇的感知健康而变化，（2）未来的鸡蛋式事件的可能性（如果苍蝇已经产下鸡蛋，则较高），（3）Z-Drift的量和（4）有时在小时时间内显然干燥的琼脂糖质量。实验者对绝大多数记录（大约95％）的神经信号与行为之间的相关性视而不见。只有在出现技术问题时才将苍蝇排除在外（例如，与持有人泄漏的两光子成像或盐水同步行为的错误）。分析了卵子沉积后的240 s到30 s的连续两光子成像的卵。 　　对于支持上升到阈值机制的CSCHRIMSON光遗传学实验（图2F – H），两光子成像参数的保持相对恒定（平均帧速率为1.5 Hz，两光子激光功率约为10.5 mW）。在试验实验中确定了Cschrimson刺激强度。周期性刺激循环每2分钟应用四个强度。在所有这些记录中，实验者对神经信号与行为之间的相关性视而不见。 　　对于Cschrimson手动刺激实验（图2A – C），实验者启动了刺激，同时观察苍蝇的实时行为。平均每7.5分钟开始一次刺激。如果苍蝇开始排卵或显示出很快排卵的迹象，通常会停止手动刺激（即停顿和轻微的腹部伸长）。一旦排卵完成，当苍蝇的腹部没有接触底物时触发刺激（在任何迹象表明即将发生自发的卵子事件之前）。图2A中所示的痕迹（以及相关的补充视频5）代表了我们的手动刺激方案。我们使用了手动刺激，因为它导致产卵率比周期性刺激高约两倍，并且还使我们能够在排卵后（自发卵产生之前）激活Ovidns。 　　对于图2C所示的Cschrimson光遗传学实验，仅显示了九个苍蝇中的五个，而所有九个均显示了两个光子成像数据，而行为数据均显示。我们不显示成像数据的四个苍蝇在cschrimson照明的GCAMP信号中流血的伪影降低了，因为这些数据是在优化最小化该伪影的检测路径之前收集的。 　　使用先前的研究66或CAIMAN69的自定义脚本校正了两光子成像框架。使用每个Z平面绘制每个Z平面的感兴趣区域（ROI）。ROI在细胞体的外边界周围绘制。将OVIDN-SS1中两个细胞体的亮度分配为OVIDNB（参见扩展数据图3C，其中我们表明OVIDN-SS1中两个细胞的较亮是OVIDNB）。在少数情况下，更明显的细胞并不明显，绘制了包含两个细胞体的ROI并被指定为ovidnb。对于给定的成像体积时间点，将所有单个Z平面ROI中的单个像素强度汇总并平均，FCELL（t）。计算了与ovidn soma或任何其他soma或soma或neurite的fbackground（t）的背景量相同的平均值。在计算∆f/f之前，我们从单元格中减去背景，fcell_actual（t）= fcell（t） - fbackground（t）。这消除了非细胞特异性信号，例如自动荧光和恒定检测器背景。这种减法还使ΔF/f稳健地鲁棒在细胞外部绘制的ROI中包含的背景像素数量的变化。使用公式（fcell_actual（t） - f0（t））/f0（t）计算∆f/f，其中f0（t）是20分钟内fcell_actual（t）的运行平均值。长时间内的平均值用于系统地估算基线，以连续波动的OVIDN信号。以前使用类似的运行平均基线估计值（尽管窗口短得多）用于量化哺乳动物中的多巴胺能信号的连续波动70。例如，∆f/f为0.35 表明细胞中的荧光信号比细胞中的20分钟均值信号大35％。如果GCAMP7F荧光信号与[Ca2+]在此范围内是线性的，则表明细胞中的[Ca2+]在细胞中的20分钟均值[Ca2+]上增加了35％。所有陈述的结论对于计算∆F/f的三种不同方法都是可靠的，包括F0保持恒定的方法。对于Cschrimson实验，F0（t）是在105 s触发后CSchrimson刺激后，在20分钟的窗口内，F0（t）是FCELL_ACTAUL（T）的运行平均值。这非常保守地阻止了F0（T）的人工影响。请注意，由于表达Cschrimson的蝇的基线尖峰速率和VM都高（扩展数据图6a，b；大约12个尖峰S – 1和–44 mV）远高于那些不相比的数据（扩展数据图9a；扩展数据；大约四个尖峰S – 1和–57 mV），我们对gcamp simber的使用范围较高，因此，我们的平均速度更高，因此，gcamp的范围更高的速度均高于正常范围。浓度，导致相同绝对钙浓度的∆F/F值较低。因此，由于Cschrimson和非cschrimson Flies在Cschrimson实验中的遗传驱动器仅在每侧三个OVIDN中表达，因此我们的遗传驱动力仅在每侧三个OVIDN中表达。 　　在Digidata 1440a（分子设备）上，将两光片成像框架脉冲，行为相机框架触发器和光遗传学LED触发器都以10 kHz数字化，并保存到计算机（Axoscoscope，Molecular Devices）。为了将时间戳分配给音量扫描，我们确定了两光音量扫描一半完成的时刻。为了将时间戳分配给行为相机框架，我们使用了16毫秒相机曝光期的开始。钙成像被插值，行为数据被降采样至常见的10 Hz阵列以进行所有人群分析。每个100 ms的时间点都从最接近的先前的时间戳（即先前的邻居插值）中分配了钙成像和行为数据值。选择相对较大的100毫秒时间基础，因为对当前的分析不需要更快的采样速度，并且考虑到收集的两光片扫描的200+ h，将在计算上耗时。在被触发的平均值的情况下，零点是具有感兴趣行为的行为摄像头的时间戳，或者随着光遗传学刺激的开始。在互相关的情况下，零点是第一个获得的两光子体积的时间戳。 　　我们使用相同的两光子显微镜进行钙成像和贴片钳电生理学。显微镜由Prairie View（Bruker）或µManager71软件控制。一个470 nm的LED（PE-100，COOLLED）通过目标提供了激发，以识别2×EGFP-或GCAMP7F阳性神经元。一个850 nm的LED耦合到400 µm宽的光纤电缆（M850F2和M28L01，Thorlabs）的聚焦在Fly的头上，以使用镜头组（MAP10100100100-A，Thorlabs）照亮细胞，以夹紧贴片夹具。记录电生理数据时，两个LED都关闭了。A×40/0.80 NA物镜（Lumplfln 40xW，Olympus）和Coolsnapez CCD摄像头（光照相）用于贴片夹。 　　通过通过移液管中的细胞外盐水中的0.5％胶原酶IV（Worthington）轻轻施加0.5％胶原酶IV（Worthington），通过破坏神经薄片和周围神经鞘来暴露细胞体。我们将胶原酶IV应用于包含感兴趣的细胞体的小30×30 µm2区域。67。使用4–6 µm-TIP微型纤维在30–32°C左右的8-80 mmHg正压约3分钟时施用胶原酶。一旦细胞体暴露，浴将恢复到约19–21°C，并没有胶原酶冲洗。 　　拉动硼硅酸盐玻璃（外径1.5毫米，内径为0.86毫米，带有细丝），以使用MF-1000微孔拔出器（Sutter Instruments）和MF-900 Microforge（Narishige）使用型号P-1000微孔拉动器（Sutter Instruments）创建7-15MΩ电极，其尖端为1.0-1.5 µm。细胞内盐水68包括140毫米 - 钾天冬氨酸，1毫米KCL，10 mM HEPES，1 mM EGTA，0.5 mM Na3GTP，4毫米MMMGATP，13 mm Biocytin hildazide和20 µm Alexa-568-568 – harexa-568 – hymydrazide-Na（热羟基）。使用KOH将pH调节至约7.3，并用水将渗透压调节至约265个MOSM。 　　使用Multiclamp 700B放大器（分子设备）以电流夹模式获得电生理信号。电生理信号和行为摄像头触发器通过Digidata 1440a在10 kHz数字化，并保存到计算机（夹具，分子设备）。没有区分记录记录的OVIDN或OVIDN样亚型（扩展数据图3）。使用OVIDN-SS1的电生理实验可以靶向OVIDNA或OVIDNB，并且使用OVIDN-GAL4实验可以靶向Ovidna，OvidnB或Ovidn类神经元。进行记录，没有当前注入（当前步骤方案除外），并以13 mV的连接电位校正了报告的膜电压（VM）。通过高通滤波VM识别尖峰，并在阈值以上分离超过1 ms的阈值以上发现峰。峰检测的参数从记录到记录的参数根据数据的目视检查而变化，在该数据中，动作电位清晰。我们通过计算每5 s间隔（0.1 ms步骤）中的尖峰数来计算尖峰速率，然后除以5，并将该值分配给5 s间隔的中间（用于扩展数据图6B，E 100 ms而不是5 s间隔）。因此，尖峰速率和VM均以0.1 ms的间隔测量。数据对齐并与钙成像相同。静止VM被认为是进入全细胞配置后的第一个稳定VM（图5D和扩展数据图9A）。我们通过丢弃（转换为NAN）的150毫秒的数据以每个尖峰的峰值（扩展数据图9C）丢弃（转换为NAN），从而计算了一个VM。 　　只有在（1）稳定记录3分钟以上的细胞时，分析了2×EGFP表达苍蝇的电生理记录；（2）VM在静止时的静止状态低于–43 mV，没有大量的漂移或显然非生理学的快速波动；（3）苍蝇至少走了一个轮旋；（4）细胞至少尖峰一次。总共五个细胞因未通过标准2、3和4而被拒绝。这五个中的三个因未传递标准2而被拒绝，而单个细胞因未传递标准3而被拒绝，表明在这种制备中苍蝇很健康。一个单元通过了前三个标准，但因不峰值而被拒绝（在扩展数据中显示了图9a）。从记录稳定到降解或终止时（平均值为41分钟）时，对通过所有四个标准的细胞进行了分析。 　　如果静止时VM低于–43 mV，则分析了表达Cschrimson的果蝇的电生理记录。所有录音均在体内进行，并在方向盘上苍蝇进行。 　　如果静止时VM低于–43 mV，则分析了Kir2.1* - 和Kir2.1的电生理记录。如自由行为实验所述，对这些苍蝇进行了预处理，而不是为束缚实验所述，因此由于它是自由行为而表达的，因此将表达转基因。所有录音均在车轮上的体内完成。用5 pA增量以1 s的电流注入（扩展数据图10D）进行了当前的步骤协议。 　　将苍蝇在大约4°C的大约4°C下进行麻醉，并将其翅膀夹在其基座附近，然后将其绑在定制的持有人身上。持有人与我们其他实验中使用的相似，除了它缺乏金字塔（这样，可以降低目标以降低图像深腹组织）并且有一个较大的孔（因此，腹部的头部，胸腔和前部可能合适，而不是头部，而不是头部）（扩展的数据图6H – J）。将胸部的背侧部分推过孔，并将后头对齐并在孔中倾斜，以与支架在平面上。用蓝光粘合胶（键）将胸腔，腹部和头部粘在支架上。将胶水应用于前腹部，以稳定制剂，并避免在解剖过程中撕裂腹部的细腻角质层。结果，苍蝇无法正常弯曲其腹部。在这种制备中，主持人没有粘合，因为长鼻延伸不会像大脑中那样引起腹神经节的运动。用针切成一条针切成背侧胸部角质层的窗户（扩展数据图6J；蓝色盒子显示解剖区域），并用镊子将角质层和间接飞行肌肉移开，使背侧胸腔前胸膜和周围的气管可见。没有细胞外盐水溶液在浴室中，除去间接飞行肌肉会更容易，从而迅速（30 s之内）以防止干燥。然后加入细胞外盐水。切开了颈部连接附近的Propentriculus的部分，并取下了肠道神经线的肠道部分以及气管和作物。用细胞外盐水冲洗制剂，以稀释解剖过程中可能已释放的消化酶。松散的组织（例如，剩余的间接飞行肌肉） 仔细去除或缩回，以使腹神经节可见。尽管去除了几个背结构以暴露腹神经和腹神经节，但苍蝇还是能走路。偶尔在丢弃成像之前或之后无法移动腿部的苍蝇。总体而言，绑扎和解剖与以前的工作共享特征72除外，需要大量的时间和精力使解剖超过颈部连接，T1，T2和T3神经粒对腹神经节。（步行苍蝇的先前成像仅限于更接近的颈部结缔组织和T1 Neuromere72,73）。在一个小的自定义加湿室内的卵形轮上方用磁铁稳定了磁铁。 　　需要在样品处使用20-30兆瓦的钙成像速率，激光功率为20-30兆瓦，以捕获足够的信号并采样全突触前体积（约为50×50×60 µm3）。在扩展数据中，成像速率和激光功率相似，以帮助比较（平均成像速率分别为0.50和0.56 Hz，所有数据的最低率为0.36 Hz）。由于分配给体积扫描的时间戳是体积完成的一半，因此在扩展数据中停止刺激后1 s的数据图6L，M应最小包含刺激期；刺激后的数据1.4 s（延迟为0.36 Hz）根本不包括刺激周期。这些数字还适用于刺激发作时∆F/F的增加。一半时间是信号值停止刺激后的时间，以在刺激结束时返回该刺激和5 s的平均预刺激。主要文本中报告的半末期时间是扩展数据中显示的三个较低强度的平均值图6d – f。To calculate an expected ∆F/F half-decay time given a spike rate, GCaMP7f kinetics and calcium imaging rate, we convolved one of our spike-rate traces (second-lowest intensity shown in Extended Data Fig. 6e) with an exponential filter (τ = 300 ms) that estimates the off kinetics of GCaMP7f17 and then applied a boxcar filter (width, 2.8 s) that simulated所有实验中最慢的帧速率。该模拟迹线的半末期为700毫秒。 　　使用蝇在方向盘上的位置确定底物过渡。对于这些分析，如果底物过渡I - 1和I+1发生在彼此4 s之内，则消除了底物过渡I。从经验上讲，这阻止了苍蝇在基板边界上摇摆的事件被算作多个过渡。请注意，对于所有过渡触发的平均值，如果苍蝇要回到第一个过渡后20 s之后的20 s，则从20 s开始时，该数据将不会导致过渡后平均值。 　　本文报告的所有光功率水平均以PM100D紧凑型功率和能量控制台（Thorlab）（Thorlabs）的预期峰值强度测量。将面积小于传感器的照明除以估计的照明面积，而不是传感器的区域。 　　德克萨斯红色（100 mg ML – 1;德克萨斯州德克萨斯州红色，3,000 MW，赖氨酸固定）（Thermofisher Cocientific）（Thermofisher Scientific）（Thermofisher Scientific）在细胞内盐水中（见上文）缺乏ATP，GTP，Biocytin和Alexa-568-568-Hydrazide-NNA被填充到Patch Pigette中。移液管位于细胞体附近（不应用任何胶原酶），并使用SD9刺激剂（Grass Instruments）施加了两到五个脉冲10 V（2 ms持续时间）。所有填充物和解剖结构都是在两光子显微镜下的方向盘上进行的（如钙成像中，除了使用×40/0.80 NA物镜（Lumplfln 40xW，Olympus）和590-650 nm带通滤波器（lumplfln 40xW，Olympus）和590-650 nm带通滤波器（Chroma）在输入第二盖斯普探测器之前（HamAmaMAtsu）。 　　如前所述筛选拆分 - gal4线并稳定。为了确定由特定的分裂-GAL4驱动器标记的细胞类型，使用标准的免疫荧光染色来计算细胞总数（扩展数据图11a – R）和多种颜色中的随机标记74用于可视化单个细胞的形态。单个细胞的形态用于手动分配细胞为Hemibrain Connectome身体IDS16，并注意到与身体ID相关的细胞类型和实例（补充表3）。 　　在图6a中，OVIDN输入神经元对的数量是基于Split-Gal4和Hemibrain Connectome 16（上）神经元的光显微镜图像之间的对应关系的估计值；使用电子显微镜连接组对OVIDNS上的突触数量是对这些神经元中OVIDNS的总数的估计（补充表3）。 　　我们使用Neuprint75（v.1.2.1）Python界面分析了成年女性雌性半纤维的突触连接。对所研究的电路架构查询所有连接至少一个突触的连接（扩展数据图11S – V）。因为Ovidns获得了输入突触的巨大数量（大约600-1,100次），并且在半纤维，直接的，直接的，双向的相互连接的OVIDN对OVIDN之间的突触中很少（大约在5至50之间）输出突触，或者在Ovidns和其他单元之间或其他细胞之间的连接，也不是可见的（也不是可见的（也是可见的）（也没有可见的数据。在半纤维中的所有复发电路（至少有十个突触）中，直接涉及卵巢（这是卵形的主要输入细胞）中，图6E中所具有的神经元是唯一简洁/直接直接通过单个Glove Glove Gloft g Group g，Untery cymin cy.6E中的神经元。我们找不到使用单个单元格的复发电路，使用单个单元格在两侧使用相同的十个避免阈值互连OVIDN（扩展数据图11U，V）。（双方之间的Ovidns相互联系是对基础电路的明智限制，因为双方在卵中卵时双方的钙信号都紧密地跟踪。）尽管我们没有发现更简单的复发循环体系结构（扩展的数据图11S – V），互补的回路可能仍然存在，或者在互补的区域中可能存在不合理的纽约，而纽约是不合适的。在现有的蝇连接组中注释。 　　尽管抑制Z组神经元也对产卵的卵也有影响（图6a），但抑制Z组的18只苍蝇中有11只仍然产下一个以上的卵。请注意，Z组神经元为OVIDN，OVIENS，G组和U组细胞提供突触输入（补充表4），有可能解释为什么抑制这些神经元时蝇会减少卵（图6A）。但是，Z组神经元很少从其他相关的细胞类中获得突触，因此它们在我们的解释中居住在核心循环之外。 　　大脑两侧的复发性电路神经元相互连接的事实有助于解释为什么两侧的OVIDN [Ca2+]信号在定性上相似（扩展数据图3F）。U组细胞和至少一个G组细胞对酪氨酸羟化酶呈阳性（扩展数据图12），这表明该复发电路的生理学可能比所有电路元件表达相同的激发递质以实现简单的，失控的激发76,77的生理学可能更复杂。76,77。 　　如先前所述进行免疫荧光染色和共聚焦显微镜检查（用于扩展数据的修改图12；请参见下文），使用以下抗体和稀释液：1:30小鼠抗Bruchpilot（no。NC82，发育研究，发育研究杂交研究），1：300 rabbit Anti-Ha Tag（NO. 300 rabbit Anti-Ha tag），1：1：no. 37 cignbal cignni cignal cignni cignni cignni cignal cignni：cignbal cignni cign cignal cignni：cignbal cignbal and cignbal cignl and。(no. NBP1-06712, Novus Biologicals), 1:500 DyLight 550 mouse anti-V5 Tag (no. MCA1360D550GA, AbD Serotec), 1:500 Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit (no. 711-585-152, Jackson ImmunoResearch), 1:600 ATTO 647N goat anti-rat (no.612-156-120，罗克兰），1：600 CY2山羊反小鼠（第115-225-166号，杰克逊免疫搜索），1：800 Alex Four 488山羊反兔子（No。A11034，Thermo Fisher Scientific），1：400 Alexaflour568 Goat Antiociic and thermocionic and 1000;兔子抗GFP（第A11122号，Thermo Fisher Scientific）。 　　为了鉴定神经递质身份（扩展数据图12），在Cold Schneider的昆虫培养基（第S0146号，Sigma-Aldrich）中剖析了大脑，并在施耐德的昆虫培养基中的4°C固定过夜，并在1％的多聚甲醛（第15713，电子显微镜科学）中固定。对于VGLUT染色，如先前所述，在Bouin的固定剂（第112016号，Ricca Chemical Co.）中，大脑在室温下固定5分钟。78。Primary antibodies and their dilutions were: 1:300 rabbit anti-TH (no. AB152, Sigma-Aldrich), 1:500 rabbit anti-serotonin (no. S5545, Sigma-Aldrich), 1:50 mouse anti-ChAT (no. ChAT4B1-s, Developmental Studies Hybridoma Bank), 1:500 rabbit anti-GABA (no. A2052,Sigma-Aldrich），1：10,000兔子抗Vglut78（来自A. Diantonio的礼物），1：1,000鸡肉抗GFP（第600-901-215号，罗克兰）和1:30 Mouse Anti-Bruchpilot（no。NC82）（否。次级抗体及其稀释液为：1：800山羊抗鸡抗鸡蛋粉488（第A11039号，Thermo Fisher Scientific），1：400山羊抗小鼠Alexa粉594（no。A11032，Thermof Isher Scientific）和1：400 Goat Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti-Rabbit Alexa Fisher 633333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333 333（将样品安装在Vectashield H-1000（矢量实验室）中，并在LSM 780共聚焦显微镜（Zeiss）上成像，并以1 µm Z-Intervals以×20/0.8 NA物镜（NO。440640-9903-000，ZEISS，ZEISS编号）。使用斐济（ImageJ）分析图像。 　　我们使用双面Wilcoxon级别测试来计算所有P值。 　　对于卵子选择的部分（例如，图3B），灰色条表示在所有苍蝇中所有鸡蛋都汇集后，将卵的分数放在了较低的核果选项上。误差线表明使用Clopper -Pearson方法计算的该分数的95％置信区间（“精确”二项式置信区间）。单个点代表个人苍蝇。 　　主文本中的前两个p值将两个单独组中的试验数与（或没有）事件进行比较。对于一个组，将事件的试验视为1，而没有事件的试验被视为0。然后使用两侧Wilcoxon rank-sum测试比较两组（每组为0和1）（使用两侧Fisher的精确测试计算得出的P值相似，并且相似地显着）。主文本中的精确p值为2.1×10–25、8.4×10–29和3.3×10–54。 　　对于图4F所示的计算，我们使用了∆F/F作为斜率计算中的起点的点，因为它仅依赖于∆F/F信号而不是行为。平均而言，ΔF/f值为0与搜索的开始有关（图1K）。使用双面Wilcoxon级别测试计算P值；P = 0.030比较腹部弯曲之前25 s的斜率时，将搜索开始到腹部弯曲的斜率进行比较时，P = 0.064。 　　免疫荧光示例如图1F和扩展数据图所示。3b，11a – r和12至少代表两个大脑（四个总脑部），通常超过三个大脑（总脑部六个）。基于电子显微镜的解剖结构如图6C所示，并扩展数据图3a是从一个脑的一侧产生的。 　　除非明确说明，否则没有排除数据。没有使用统计方法选择样本量。实验者对飞行基因型并不盲目。每个实验都会随机选择苍蝇。 　　除非另有说明，否则使用MATLAB（MATHWORKS）或PYTHON进行所有数据分析和仪器控制。所有用于3D打印或激光切割的设计均使用Autodesk Inventor（Autodesk）进行，该设计也用于帮助创建图1D和扩展数据图2A – C。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。