靶向病毒膜蛋白的冠状病毒组件抑制剂

　　动物住房条件和实验程序得到了KU Leuven动物实验伦理委员会的批准（许可证P001/2021） 。 　　综合和表征在补充方法中描述
。 　　GS-441524获自Medchem Express（HY-103586）。羟氯喹购自细胞信号技术（85523s） 。Nirmatrelvir（PF-07321332）来自Wuxi。 　　VEOE6-GFP细胞（表达绿色荧光蛋白的非洲猴肾细胞系；由M. van Loock ，Janssen Pharmaceutica40提供的M. Van Loock提供
，并在Dulbecco的修改后的EAGLE培养基（DMEM）中，并补充了10％V/V热灭活的胎儿牛油（FBS）+0.5 mg-1 gentenicin
。VEOE6-MCHERRY细胞（如参考文献41中所述生成）在DMEM中维持 ，补充了10％（v/v）热灭活的FBS和10μgml-1 blasticidin。用于抗病毒研究的A549ACE2+TMPRSS2细胞（一种过表达人ACE2和人TMPRSS2受体的过表达人ACE2和人类TMPRSS2受体）来自Invivogen（A549D-COV2R，A549D-COV2R
，A549 DIX DUAL HACE2-TMPRSS2细胞），并在DMEM中培养 ，并在DMEM中培养
，并补充10％VMEM versiv fotiv in300μgml -1湿霉素，0.5μgml -1嘌呤霉素和10μgml -1 blasticidin 。使用用于亚细胞研究的A549ACE2+TMPRSS2细胞是由从ATCC（CCL-185）获得的内部内部产生的 ，该内部使用andiviral Transduction用编码ACE2的PWPI载体（使用500μgML-1遗传因素）（选择了1 prynor）（选择1 prysor）（选择1 pryer）（选择1 pryso）（选择1 pwpi）（选择）（选择1 p. ML）（选择）
。控制。将这些细胞培养在补充有10％（v/v）FBS
，100 U ML-1青霉素，10 µg ML-1链霉素和1％非必需氨基酸的DMEM中 。使用VEOE6 – GFP ，VEOE6 -MCHERRY和A549ACE2+TMPRSS2涉及病毒复制的所有测定均在包含2％（而不是10％）FBS的各个细胞生长培养基中进行
。所有细胞培养物均在37°C和5％CO2下进行。BHK-21细胞（从ATCC
，CCL10获得的婴儿仓鼠肾细胞系）维持在补充了5％V/V FBS，10％胰蛋白酶磷酸汤 ，100 U ML-1青霉素
，100 µg ML-1链霉素和10 mM Hepes，ph 7.4的Glasgow Mem（Invitrogen）中 。对于转染实验 ，如所述，将细胞保持在Eagle的最小必需培养基（EMEM）中
，如所述4​​2
。将HuH7细胞培养在补充10％FBS和1 mM谷氨酸的DMEM中。 　　A549TMPRSS2+DPP4 cells (A549 obtained from ATCC (CCL-185), developed in-house to overexpress human TMPRSS2 and DPP-4) were cultured in DMEM supplemented with 5% FBS, penicillin (100 U ml−1), streptomycin (100 μg ml−1), blasticidin (10 µg ml−1) and geneticin（0.1 mg mL -1） 。使用5％FBS，青霉素（100 U mL-1）和链霉素（100μgml-1）的DMEM用于MERS-COV感染实验
。在补充了5％FBS的DMEM中培养了HCT-8细胞（从ATCC ，CCL-244获得的人结直肠癌细胞系）。DMEM+3％FBS用于HCOV-OC43感染实验 。将CRFK细胞（Crandell-Rees猫肾肾细胞系从ATCC
，CCL-94获得）在补充的DMEM中培养，其中补充了5％FBS ，青霉素（100 U ML-1）和链霉素（100μgML-1）。相同的培养基用于涉及FIPV感染的实验
。LLC-MK2细胞（从ATCC
，CCL-7获得的恒河猴肾肾上皮细胞系）与Hanks的MEM培养，Earle的盐补充了5％FBS。MEM与Hanks和Earle的盐和3％FBS一起用于HCOV-NL63感染实验 。将Vero细胞（ATCC ，CCL-81）培养在补充5％FBS
，青霉素（100 U ML-1）和链霉素（100μgml-1）的DMEM中
。使用青霉素（100 U ML -1），链霉素（100μgml -1）和1 µg ML -1胰蛋白酶的DMEM用于PEDV感染实验。所有细胞系对支原体污染的阴性测试 。 　　SARS-COV-2 GHB菌株（GHB-03021/2020 ，GISAID：EPI_ISL_407976 | 2020-02-03）是从从中国沃汉（Wuhan）返回的无症状的患者中从鼻咽拭子中回收的
。将病毒储备接种在Hu-7细胞上
，然后在VEOE6-EGFP细胞上转移了7次。GHB在残基676–680处具有ΔTQTNS缺失，这对于在VEROE6细胞上传递的SARS-COV-2菌株是典型的43 。属于Alpha ，Beta，Delta和Omicron变体的SARS-COV-2菌株从通过逆转录（RT – QPCR）确认的人类病例的鼻咽拭子中回收了人们关注的关注
。通过在Calu-3细胞上传播病毒
，然后在A549ACE2+TMPRSS2细胞上生产筛查病毒库存来产生病毒量。这些菌株中的段落0的序列可通过GISAID获得：alpha/b.1.1.7（HCOV19/BERGIUM/REGA/REGA-12211513/2020; EPI_ISL_791333），β/B.1.351（HCOV19/BELGIUM/RECA/REGA/REGA/RECA-1920/20221; EPI__ISL;delta/b.1.617.2（epi_isl_2425097）;Omicron Ba.5（Epi_isl_14782497）;和XBB1.5（epi_isl_17273054） 。BA.2.86（SARS-COV-2/HU/DK/SSI-H135）和EG.5.1（SARS-COV-2/HU/HU/HU/DK/SSI-H121）的序列在欧洲核苷酸档案中可用 ，该核苷酸存档在项目编号PRJEB67449下
，带有辅助数字OY747653和OY7474444494449449，该项目编号为PRJEB67449
。SARS-COV-2 BAVPAT1/2020菌株由C. Drosten（CharitéBerlin）通过欧洲病毒档案档案（Ref-Sku：026V-03883）提供。该病毒在S蛋白中具有D614G突变 ，并且由于对Veroe6细胞的传播而影响脂肪蛋白裂解位点的突变已用于亚细胞研究22 。重组SARS-COV-2-MNEONGREEN病毒（Wuhan Strain）44是V. Thiel（伯尔尼大学）的礼物。SARS-COV-2 USA-WA1/2020（EPI_ISL_404895）用于仓鼠功效研究
。该病毒是通过BEI资源（ATCC
，NR-52281，批次70036318）获得的。该分离株与原型Wuhan-hu-1 2019-ncov密切相关 （GenBank登录112：MN908947.3）菌株 ，如系统发育分析所证实 。 　　RSARS-COV-2 WT-USA-WA1
，RSARS-COV-2 WT-USA-WA1-3CLPRO：L50F，RSARS-COV-2 WT-USA-WA1-3CLPRO：T21I-D263G ，RSARS-COV-COV-COV-COV-COV-2 WT-ISA-WA1-WA1-WA1-3CLPRO：L50f-e1666a l16666666666667.SARS-COV
，200300592菌株是从疾病控制和预防中心获得的
。实时的SARS-COV-2和SARS-COV工作是在A3和Biosafety级别的3级设施中完成的，根据Institudational Guideraline Audituditational Guideraline ，根据Institudational Guideraline Auditudational Guideraline。所有与Live SARS-COV（Frain Frankfurt-1）和MERS-COV（Jordan N3/2012菌株）病毒的所有工作都是在莱顿大学医学中心的生物安全3级实验室中进行的 。 　　这项研究中使用的其他冠状病毒是：MERS-COV分离式英格兰1，标识符：1409231V
，全国致病病毒的收集，英国公共卫生 ，英国公共卫生（在Jagiellonian University进行研究）；HCOV-OC43（ATCC VR-1558）
，FIPV菌株79-1146（由G. Tekes，Justus Liebig University Giessen授予）；HCOV-NL63分离株阿姆斯特丹1（GenBank：AY567487.2）45;PEDV CV777（由C. M. Lia van der Hoek授予 ，阿姆斯特丹大学46号）
。在扩展数据表1中提供了用这些病毒进行的抗病毒测定的简短描述。 　　在96孔板（Greiner Bio One
，655090）中，将VEOE6 – GFP细胞以每孔25,000个细胞的密度接种 ，并在MDR1抑制剂CP-100356（最终浓度
，0.5μm）的情况下用三倍的化合物稀释液预处理 。第二天（第0天），细胞被SARS-COV-2接种物感染 ，每个细胞中位数为0.001 TCID50的多种感染（MOI）
。感染后第4天通过高含量成像确定的GFP信号的荧光像素的数量被用作读出。通过减去背景（未处理的 - 感染对照井中的荧光像素的数量）
，并将其标准化至未处理的 - 未感染的对照井（也减去背景）来计算抑制百分比 。通过对数插值确定EC50
。使用类似的方案来确定A549ACE2+TMPRSS2（Invivogen）细胞中的抗病毒活性，但没有使用MDR1抑制剂CP-100356 ，并在感染后四天使用与生存能力染色在感染后四天确定了细胞活力。3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲氧基苯基）-2-（4-硫苯基）-2H-四唑（MTS） 。抗病毒活性的百分比是通过减去背景并标准化为未经处理的 - 未感染的对照井（也减去背景）来计算的，并使用对数插值确定EC50。在这两种细胞系中
，在处理的 - 未感染的培养物中，在类似的培养物中评估了化合物的潜在毒性 ，其中使用MTS分析在第5天定量代谢活性
。通过对数插值计算50％的细胞毒性浓度（CC50
，细胞活力降低至50％的浓度）。 　　对于使用HCOV-NL63，FIPV ，PEDV
，HCOV-OC43和MERS-COV的抗病毒测定，在感染前一天 ，细胞被播种 。第二天
，将连续化合物稀释液与病毒（1：1 v/v）混合，在室温下孵育30分钟 ，并在汇合细胞上覆盖
。然后将细胞与相关病毒在37°C（FIPV
，PEDV和MERS-COV）或32°C（HCOV-OC43和HCOV-NL63）中孵育2小时。将细胞用PBS洗涤两次，然后在37°C（对于FIPV ，PEDV和MERS-COV）或32°C（HCOV-OC43和HCOV-NL63）中进一步添加含有化合物的化合物，并在32°C下孵育3-5天
，并收集RT – QPCR 。对于HCOV-229E分析，在96孔板中制成了化合物中化合物的三个系列稀释液
。之后 ，添加HuH7细胞悬浮液以每个孔的密度为10,000个细胞的密度分析井
，并以0.01的MOI感染HCOV-229E。感染后5天使用MTS的生存力染色确定细胞活力 。对于SARS-COV CPE减少测定，将VEOE6细胞（每孔11,000个细胞）和MERS-COV CPE还原测定测定 ，Huh-7（每孔10,000个细胞）
，在感染前一天，在96孔板中播种
。The next day, two-fold serial dilutions of compound in infection medium with 2% FCS (and 0.25 µM p-GP inhibitor CP-100356 for VeroE6 cells) were added to cells (eight dilution series in parallel), and half of the plate was infected with SARS-CoV Frankfurt-1 (300 plaque-forming units per well) or MERS-CoV Jordan-N3/2012 (200 plaque-forming每个井单元）。板的另一半被模拟感染 ，以确定化合物并行的细胞毒性作用 。感染后三个（对于SARS-COV）或两（MERS-COV）
，使用CellTiter 96水溶液非放射性细胞增殖试剂盒（Promega）测量感染（n = 4）和未感染细胞的细胞生存能力（细胞毒性，n = 4） 通过带有设想读取器（Perkin Elmer）在495 nm处的吸光度测量
。将井的值标准化为未感染未处理细胞的平均信号（100％）。通过非线性回归确定EC50和CC50值 。 　　Nirmatrelvir（来自Excenen ，Exa5024批次）在含有43％的绝对乙醇和27％的丙烯乙二醇（Sigma）的车辆中
，以100 mg ML -1和33.3 mg ml -1股票（分别为300 mg / kg的300 mg和100 mg剂量）。CIM-834在14％丙烯（Sigma），1％Tween 80（Sigma） ，85％pH 5 pH 5柠檬酸盐缓冲液中配制为20 mg ml-1
。为了评估体内功效，通过口服烤器（n = 12
，每天两次，两次）或每天100 mg（n = 12 twice） ，每天100 mg或n = 12（n = 12
，每天两次）或每公斤100毫克（n = 6，每天两次） ，从第0天开始
，就在与Beta变体b.1.351（HCOV-19/BELGIUM/REGA-1920/2021; EPI_ISL_SILL_896474，2021-01-111）感染之前。对于病毒感染 ，用异氟烷麻醉动物
，并用含有105 TCID50 SARS-COV-2β变体的40 µL鼻内接种（第0天） 。在治疗装置中，在第0天感染了动物 ，并在感染后24小时
，30小时或48小时开始用CIM-834（每公斤100 mg，每公斤100 mg）进行治疗
。将小鼠安置在每个笼子中有三只小鼠的单独通风笼中 ，并每天监测重量变化和任何临床体征。在感染后的第3天，通过腹膜内注射100 µL Dolethal（200 mg ml -1五戊巴比妥钠
，vétoquinolSA）对动物进行安乐死，并收集了肺 。通过终点病毒滴定对传染性病毒肺荷载进行定量
。为了防止在确定传染性病毒滴度的过程中 ，化合物的承载
，在与肺匀浆中孵育2小时后，将细胞洗涤并给予新鲜培养基。随后将细胞在TCID50读出之前在37°C下孵育三天 。 　　先前已经描述了SARS-COV-2的仓鼠感染模型47
。来自Janvier实验室的叙利亚仓鼠（Mesocricetus auratus）在21°C ，55％C湿度和12 h：12 h：12 h Day：夜晚的环境中
，将Janvier Laboratories的8-10周大8-10周大。住房条件和实验程序得到了KU Leuven动物实验伦理委员会的批准（许可证P065-2020） 。为了感染，将动物用氯胺酮/甲基嗪/阿托品麻醉 ，并在鼻内接种50 µL
，其中含有1×104 TCID50的SARS-COV-2 USA-WA1/2020
。用口服烤仓鼠用车辆进行口腔饲料处理CIM-834+Ritonavir（每公斤100+50毫克）或Nirmatrelvir（每公斤300毫克），每天从第0天开始两次 ，直接在SARS-COV-2之前直接在感染之前。所有治疗方法一直持续到感染后的第3天 。在第4天
，通过腹膜内注射500μLDolethal（200 mg ml -1五戊巴比妥钠，vétoquinolSA） ，对仓鼠安乐死。收集肺并通过RT-QPCR和终点病毒滴定对病毒RNA和传染性病毒进行定量，并将左肺叶固定在4％甲醛中进行组织病理学分析
。进行了两项独立研究
，每项研究总计为CIM化合物组和Nirmatrelvir组的n = 8。同时，我们评估了用CIM-834/Ritonavir治疗感染的动物是否可以防止感染传播到未感染的接触仓鼠 。For this, starting in the afternoon of day 1 after infection, each index infected hamster, treated with either vehicle (n = 4) or CIM-834 + Ritonavir (100 + 50 mg per kg, n = 8), was co-housed with untreated sentinel hamsters in one cage, and the co-housing continued until the day of euthanization, three days after the first exposure. 　　为了进行组织学检查 ，将肺固定在4％甲醛中并嵌入石蜡中
。用血久毒素和曙红染色后
，分析组织切片（5μM），并盲目地对病理学家进行肺损伤。评分的参数为0-3的分数是：充血 ，支气管内的肺泡内出血
，支气管壁中的凋亡人体，可死性支气管炎 ，周围血管性性交症
，支气管疾病，支气管炎 ，骨膜炎性
，骨膜造成症，血管造成炎症 ，血管症和血管症 。然后，不同分数的总和报告为累积分数
。 　　SARS-COV-2 B.1.1.7在CIM-834浓度增加的情况下
，在A549ACE2+TMPRSS2（Invivogen）细胞中传递。选择以0.03μm（其EC50的1/3左右）启动，对于每个传递 ，将病毒以相同的浓度培养
，并以3×，10×和30倍较高的浓度培养 。然后 ，通过明显的细胞病变作用观察到的最高化合物浓度的培养物仍显示出病毒突破
。在第5（第17天）时
，对细胞培养培养基中的VRNA进行了测序。 　　根据制造商的说明，使用Nucleospin RNA病毒试剂盒（Macherey-Nagel）从细胞培养上清液中提取RNA 。Whole-genome sequencing was outsourced to Eurofins Genomics (ARTIC SARS-CoV-2 WGS, Konstanz), who performed reverse transcription, enrichment of the viral genome using a primer set similar to the ARTIC primers (more than 200 primer pairs, covering the full 29.9-kilobase viral genome), generation of libraries, Illumina sequencing (2 × 150 base-pair read mode) and序列清洁以去除适配器和质量较差的基础
。Sequences were further analysed using Geneious Prime software (v.2022.2.1) by mapping to the SARS-CoV-2 reference sequence (NC_045512), and variant calling was performed as described by the software manufacturer (https://help.geneious.com/hc/ en-us/articles/360045070991-Assembly-of- SARS-CoV-2-genomes-from-瓷砖 - 放大元素 - 序列 - 使用圣经的prime）。 　　通过将核苷酸位置26916–26918突变为26916–26918从CCG到AGC构建的反向工程的SARS-COV-2 WUHAN用M蛋白p132s取代构建 ，在细菌性人工染色体矢量中
，该染色体载体中含有全长长长的CDNA，使用SARS-COV-2/NLD-NLD-NLD-nld GEIDEN的全长CDNA拷贝 ，在大肠杆菌中进行两步的重新组合48： 　　5'-tcttctCaAcgtgCCACTCCATGGCACTATTCTGACCAGCAGCTTGCTAGAAGAAGTGAACTCGTAATGGCGTATGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCGTC-3'and 　　5'-cacgagatcacagctccgatcgatcgagttcactttcttctagcaagcttctggtcagaatgccagcagcctaggcatagggataaCagggggggtaatggcctg-3' 。 　　随着引物的设计
，在核苷酸位置26919和26921引入了静音标记突变，将CUU密码子更改为UUG。在M蛋白基因上测序了两个独立的突变体BAC ，并用Noti线性化了5 µg DNA
。通过用T7 RNA聚合酶在体外转录获得全长RNA，然后根据制造商的方案（Mmessage-Mamachine T7 Kit
，Ambion）进行氯化锂沉淀。如先前所述，生成了编码SARS-COV-2 N蛋白的合成mRNA 49 。为了启动SARS-COV-2野生型和突变体 ，使用Amaxa核对象2B（程序A-031）和核配置T溶液KIT（LONZA）将5 µg全长SARS-COV-2 RNA和10 µg N蛋白mRNA电视分成2×106 BHK-21细胞
。将转染的细胞与4×106 VEOE6细胞混合
，并在37°C下孵育细胞，直到观察到全细胞病作用。从该通道0病毒库存中 ，如所述50在Calu-3细胞上制备了通道1库存 。通过Illumina测序证实了AGC密码子在核苷酸位置26916–26918（p132s）的存在（见上文）
。该测序还表明
，在病毒主链中没有意外引入其他突变。 　　构建了反向工程的SARS-COV-2 BF.7（Omicron），从七质量反向元素System51开始 ，用于菌株SARS-COV-2/USA_WA1/2020（P. Y. SHI的礼物
，始于世界的新兴病毒和Arboviruses的世界参考中心） 。使用QIAAMP病毒RNA试剂盒（Qiagen），由SARS -COV -2 Omicron子变量BF.7（由Rega Institute P. Maes捐赠）的临床分离株制成RNA提取物
。接下来 ，用随机的六聚体引物和上标IV RT第一链合成系统（Invitrogen）制成cDNA。使用铂SuperFI PCR（Invitrogen）（Invitrogen）
，将cDNA用作模板，以制造覆盖病毒基因组的七个PCR片段 ，并包含与靶质粒重叠的模板 。使用Nebuilder HIFI DNA组件克隆试剂盒（新的Biolabs），七个质粒51中的WA1序列被Omicron-OMICRON编码的PCR片段代替
。M蛋白取代P132S是由Q5定点诱变（新英格兰Biolabs）引入的。使用铂SuperFI II DNA聚合酶（Invitrogen）引入了M蛋白取代M91K
，S99A和N117K 。 　　所有质粒均通过Sanger测序（Macrogen）验证。如先前所述51进行病毒DNA，体外转录和BHK-21细胞的电穿孔 ，除了使用ECM 830方波电穿孔系统（850 V
，3脉冲，0.30 ms ，3 s间隔
，3 s间隔，BTX）
。将电穿孔细胞添加到含有10％FCS的培养基中的A549ACE2+TMPRSS2细胞（Invivogen）中。在37°C下孵育6小时后 ，用0.2％FCS代替培养基 。四天后
，收集了病毒库存，在A549ACE2+TMPRSS2（Invivogen）上进行了一次传递 ，并进行了全基因组测序（牛津纳米孔技术
，由B. vanmechelen，Rega Institute）进行验证 ，以验证所需的序列
。 　　先前描述的程序52被遵循。简而言之，人类气道鼻上皮细胞（供体的粘液池
，产品代码EP02）是从空气液体设置中的上皮获得的 。到达后，将插入物用预热的1×PBS洗涤 ，并在使用前四天保持在37°C和5％CO2的粘膜培养基（上皮
，EP04mm）中
。在实验当天，将培养物用含有不同浓度的化合物的基础培养基预处理1小时 ，然后在顶端用100μlSARS-COV-2接种物（每插入1,000 TCID50）在1.5 h感染
，然后将病毒接种物去除。通过用250 µL粘液培养基清洗顶部的顶部，并通过RT -QPCR或滴定测定病毒载荷 ，从而测量培养基的病毒释放 。感染后第2天
，对培养基基底外侧的含化合物培养基进行了刷新
。从感染开始的所有温育均在35°C和5％CO2下进行。 　　使用细胞到CDNA II缓冲剂试剂盒（Thermo Fisher Scientific，AM8723）分离来自顶端洗涤（空气 - 流动培养物插入物）或细胞中的病毒RNA 。简而言之 ，将5μl洗涤液添加到50μL裂解缓冲液中
，或在细胞裂解缓冲液中裂解细胞（每μL细胞裂解II缓冲液）中的细胞裂解缓冲液（2,500个细胞）；将样品在室温下孵育10分钟，然后在75°C下孵育15分钟
。接下来 ，在RT – QPCR之前，将150μl无核酸酶的水添加到混合物中。同时
，使用相同的方案提取了相应病毒量的十倍连续稀释，然后可以随后作为标准曲线发挥作用 。The amount of viral RNA was quantified by RT–qPCR using an iTaq universal probes one-step kit (Bio-Rad, 1725141) and a commercial mix of primers for the N-protein gene (forward primer, 5′-GACCCCAAAATCAGCGAAAT-3′; reverse primer, 5′-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG-3′) and probes（5'-FAM-ACCCCCGCATTACGTTGGTGGTGGTGGACC-BHQ1-3'）来自IDT Technologies（10006606）。反应（最终体积为20μl）由10μl的一步反应混合物组成2× ，0.5 µL RT酶
，1.5μl的底漆和探针混合物，4μl无核酸酶的水和4μL样品
。在LightCycler 96热环生（Roche）上执行RT -QPCR ，从50°C开始
，持续15分钟和95°C，持续2分钟 ，然后在95°C下的45个周期为3 s
，在55°C下为30 s。通过将病毒库存的十倍连续稀释的CT值与已知滴定（标准曲线）相关联，来自样品的VRNA量可以表示为每个细胞培养插入物（每个插入物的TCID50等效）的TCID50等效物 。 　　在感染前一天将Veroe6细胞接种在12孔板中
。细胞用每个细胞1 TCID50（SARS-COV-2 GHB）感染 ，并在感染后加入0 、3
、5和7小时。感染后10小时
，去除含病毒的上清液，并通过RT-QPCR裂解细胞以定量VRNA水平（请参阅上文） ，或收集细胞，以确定斑块测定的细胞内感染性病毒滴度（见下文） 。对于记者细胞和报告基因病毒的毒品中进测定时间
，在感染前一天将Veroe6-Mcherry细胞接种在96孔板中
。感染细胞被SARS-COV-2 – MNEONGREEN病毒（最终MOI为0.1 TCID50），并在感染后加入-0.5、0.5 、0、2
、4、6和8小时。感染后10小时 ，使用高内心成像对细胞进行成像
，并计算了感染细胞的数量，此后计算了相对于DMSO处理的对照的百分比抑制 。 　　将细胞胰蛋白酶素化并重悬于PBS中 ，然后将其冷冻在液氮上3×冻融以释放细胞内病毒颗粒
。通过离心去除细胞碎片（在13,400 rpm和4°C下5分钟）
，并使用50 µL上清液来确定斑块测定的传染性滴定。 　　为此，将5倍的细胞裂解物上清液稀释液添加到12孔板中的Veroe6细胞单层中 ，并在37°C下孵育1小时 。随后
，在补充了2％FBS的DMEM中，接种混合物被替代0.8％（w/v）的甲基纤维素
。在37°C下孵育三天后 ，去除覆盖物
，用3.7％的PFA固定细胞，并用0.5％的晶体紫罗兰色染色 ，并在视觉上对斑块计数。 　　将SARS-COV-2 M和E蛋白的编码序列克隆在PCDNA3.1（+）载体的BAMHI和ECORI限制位点之间，该位点分别包含用于氨基末端V5 TAG的编码序列或M和E蛋白的Carboxy-terminal HSV TAG 。To this end, cDNA obtained after reverse transcription of RNA extracted from SARS-CoV-2 (strain LillehCoV-19/France/HDF-IPL/2020, GenBank MW575140) infected cells was amplified by PCR using Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs) with forward primer 5′-CGGGATCCGCAGATTCCAACGGTACTATTA-3′ and反向底漆5'-cagaattCaaagcaaagcaAta-3''
，向前底漆5'-TCGGATCCGCCCGCCCACCACCACCACCACCATGTACTCATTCATTCGT-3''和反向底漆5'-TGGAATTCGACGACCAGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGAAGGAACACACACACTC-3'，以使E.允许E. sere nn 5 nn 5 nn 5用于所有VLP研究。该M-N5Q糖基化位点突变体是由位于前向底漆的位置定向诱变PCR生成的 ，该诱变PCR使用正向引物5'-CGGGATCCGCAGCAGATCCAAGTCCAAGGTACTACTATACTACCGTT-3'和反向启动5'-Cagaattcttacttacttactgtacaagcaaagcaaagcaaagcaaagcaaagcaata-3'
。使用引物PCR使用引物5'-CTTTCTAGAAGCGATCTGGTCAGAATGCCCAT-3'和5'TTTCTGACCAGATCGCTTCTCTCTCTAGAAAGAAGTGAAGTGAAGTGAAGTACTCGT-3'通过融合PCR引入M（P132S）突变。For E, a silent mutation removing the intrinsic EcoRI restriction site was inserted at nucleotide position 195 (G > A) by fusion PCR using the primers 5′-GAATTTAGATTTTTAACACGAGAGTA-3′ and 5′-AATCTAAATTCTTCTAGAGTTCCTGA-3′. 　　将HuH-7细胞53在每盘2×106细胞的浓度下播种在100毫米菜肴中 。第二天
，将细胞培养培养基更改为含有各种CIM-834（0.2 、1.0或5.0 µM）或DMSO的培养基
。使用Transit-LT1转染试剂（Mirus Biio），将细胞与2 µg编码野生型或突变体（M（P132S））蛋白（M（P132S））蛋白（M（P132S））蛋白（M（P132S））共转染。然后 ，转染后48小时
，收集了VLP和细胞裂解物，并按照先前的MERS-COV VLPS进行的54如前所述存储 。将VLP和裂解物样品重悬于减少Laemmli加载缓冲液中 ，并通过SDS -PAGE在12％聚丙烯酰胺凝胶上分离
。通过使用主要抗V5抗体（Thermo Fisher Scientific
，R96025，Clone SV5-PK1 ，1：1,000）和继发性HRP标记的山羊抗小鼠IgG IgG抗体（Jackson Immunoresearch
，115--035-146，1：10,00054） ，可视化M蛋白通过免疫印迹（Thermo Fisher Scientific，R96025
，R96025，R96025 ，R96025
，R96025，R96025 ，1：1,000）可视化M蛋白。微管蛋白用作负载对照
，并使用小鼠抗β-微管蛋白IgG1抗体（Sigma-Aldrich，T5201 ，克隆浴缸2.1
，1：2,000）染色 。使用图像J及其带定量函数对蛋白质印迹带进行定量
。有关未处理的印迹，请参见图1。 　　A549ACE2+TMPRSS2细胞（内部生成）在两玻璃盖上的24孔板中培养 ，用于微波炉辅助化学加工或3毫米平面蓝宝石圆盘50μm（工程学办公室M. Wohlwend
，M.Wohlwend，Switzerland ，Switzerland），以进行高压力释放 。感染SARS-COV-2（菌株BAVPAT1/2020）后一小时
，用1 µM CIM-834或Nirmatrelvir或DMSO对照处理细胞
。并联处理了用DMSO或Nirmatrelvir或CIM-834处理的模拟接种细胞。在感染后10小时收集细胞，分为两步 。首先 ，通过在室温下以1：1的比例在1：1的比例中添加2倍浓缩的EM固定剂
，然后在室温下将1×浓缩固定剂在120分钟内添加15分钟。1x固定剂的组成为2.5％戊二醛和1％甲醛在50 mm Na-cacodylate缓冲液（pH 7.2）中，其中含有50 mM KCl ，2.6 mM MGCL2
，2.6 mM Cacl2和2％蔗糖
。将板在Phem缓冲液（pH 7.4）中的6％EM级甲醛的浴中浸入病毒灭活30分钟，并保持在4°C ，直到第二天进行进一步加工。使用配备真空室（设置为20 Hg）和水冷平台（设置在23°C）的Pelco Biowave Pro+微波炉（设置在23°C）
，在室温下进一步处理样品 。将样品用100 mM Na-cacododylate冲洗六次，每次10分钟 ，然后在65 mm Na-Cocodylate缓冲液中的微波炉中固定
，在150 MW处1％OSO4，在真空下每2分钟开关每2分钟 ，每2分钟骑自行车，七个循环
。然后将样品用两次耗尽的水冲洗四次（在板凳上两次持续10分钟
，每次在250 mW的微波炉中每次两次持续40 s，然后在250 mW的微波炉中进行 ，然后在1％乙酸盐中在1％的乙酸铀中进行处理
，在生物盐中的双层水中在乙酸乙酸氨基盐中，每次在2分钟内 ，每个循环2分钟
，每个周期为2分钟，每次循环（100 mW） ，在下面循环循环。用乙醇系列脱水（50％
，70％，90％和2×100％） 然后 ，在100兆瓦的每一步进行40秒钟
，真空熄灭 。最终将盖玻片转移到新鲜100％Epon 812树脂上的Beem胶囊中，并在60°C聚合48-76 h
。 　　在蓝宝石上制备的用于高压冻结的细胞在6％PFA中的BSL3前缀并导出 ，类似于盖玻片上的样品。然后将样品用PHEM缓冲液（100毫米）冲洗六次，浸入100毫米PHEM中
，使用Baltec HPM-010，用15％BSA作为冷冻保护剂和高压冷冻 ，并形成40 µm-MM-Deep型腔（3毫米铝载体
，B 0/0.3 mm和type 748 0.0 448/0.04），Wohlwend） 。然后 ，使用带有螺钉盖和橡胶密封环的冷冻样品进行高压冷冻样品在Leica AFS II中进行冷冻取代
，其中包含1 ml固定鸡尾酒，由0.2％OSO4 ，由1％乙酸铀酰乙酸铀酰和5％的水组成
。在24小时内
，AFS腔室温度升高：-90°C时1小时；在-90°C至-80°C时8小时；8小时在-80°C至-50°C；在-50°C至-20°C下2小时；在-20°C至0°C下2小时。然后将样品用干燥的丙酮在冰上冲洗5分钟，然后使用微波炉进一步处理 ，在250兆瓦时用乙醇冲洗两次40 s
，并随着乙醇的Epon 812浓度升高（10％，30％ ，50％，50％
，70％，90％ ，90％
，90％，90％和2×100％的乙醇浓度 ，每个生物均为3分钟 。在Epon 812的最后100％步骤中
，将蓝宝石转移到AFS塑料模具中，并在60°C下聚合48-72 h
。分别使用UC7 Leica Ultramicrotome和30°的钻石刀（DiAtome） ，分别为化学固定和高压冷冻样品生成了70 nm或300 nm的超薄蛋白切片
，并在化学固定和高压冷冻样品中产生，并在Pioloformoform涂层的Slot网格上收集。将网格在70％甲醇中用3％乙酸铀酰和柠檬酸铅的2分钟染色5分钟 。为了找到受感染的单元 ，序列 - EM导航器功能和根据参考文献进行了改编的程序。55用于在配备TEMCAM-F416相机的JEOL 1400上绘制5条的中央部分
。鉴定出显示DMV群集的单元格
，并存储在地图中， 然后将导航器图和网格转移到配备Matataki SCMOS摄像机的JEOL 2100+上 ，以获取蒙太奇，以×6,000或×15,500的放大倍率覆盖所选单元的整个核周区。 　　对于断层扫描
，使用配备有Gatan Oneview摄像头的Tecnai F30显微镜（Thermo Fisher Scientific）对200 nm或300 nm的静态部分进行筛选和成像 。通过单轴断层扫描（每个像素为0.78 nm），以×15,500的放大倍率（-60°至 +60°）手动选择目标位置（-60°至 +60°）
。使用IMOD56,57,58重建倾斜系列。使用Amira-Avizo软件V.2020.1（Thermofisher） ，卷渲染和动画中的Brush分割工具手动完成了所选断层图的分割 。 　　我们仅在25°C下仅在25°C的缓冲液中孵育30分钟（20 mM HEPES
，pH 7.5，150 mM NaCl ，0.001％LMNG
，0.0001％CHS，0.00033％GDN ，添加了2％DMS​​O）或以CIM-834（CIM-834（dmso）（2％）（2％浓度）
。根据制造商的协议
，通过Zeba旋转脱盐柱（7 K MWCO）将未结合的化合物从结合的化合物从结合的化合物到蛋白质。所有实验均以三份进行 。质谱法测量是在用串联质谱法的液相色谱法上安装的6546四倍飞机飞行时间进行的
。为了进行数据分析，使用了敏捷的群众猎人合格分析软件（目标筛选工作流程）和通过公式方法进行的 ，以通过质量/同位素模式匹配进行复合识别。使用10 ppm的质量误差窗口提取[M+H]+
，[M+Na]+和[M+K]+质量的EIC峰面积 。 　　对于Fab-E和Fab-B复合物，M蛋白与CIM-834和Fab-E或Fab-b结合使用 ，导致最终浓度为44.44 µM M蛋白，100 µM CIM-834和Fab-e/B在2.2摩尔多余的M蛋白中
。将所有组件稀释在pH 7.7
、150 mm NaCl
，0.0025％LMNG和0.00025％CHS的pH 7.7、150 mm NaCl的缓冲溶液中稀释。在玻璃化之前将样品混合并在冰上孵育15分钟 。将大约3.5 µL的样品移到了发光的R1.2/1.3 200网格孔铜碳网格（Quantifoil）中，然后使用Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher Scientific）在液态乙烷中插入液体中。这两个数据集均在荷兰电子纳米镜检查中心收集
。将网格装入以300 kV为单位的Titan Krios Electron显微镜（Thermo Fisher Scientific） ，配备了K3 Direct Electron探测器和生物量子能量过滤器（GATAN）。能量滤波器的缝隙宽度设置为20 eV 。使用EPU软件（Thermo Fisher Scientific）以超分辨率模式（Thermo Fisher Scientific）以×81,000的名义放大倍率进行成像
。分别为Fab – E和Fab -B Complex es录制了总共5,058部和5,037部电影。详细的数据收购参数总结在扩展数据表2中 。 　　对于Fab – E和Fab-B复合物
，使用输出F-CROP系数为0.5，贴片运动校正 ，在CryoSparc59中进行了贴片CTF估计
。丢弃了CTF估计分辨率估计分辨率较差的显微照片
，分别丢弃了5,058和5,036张图像以进行进一步处理。然后，使用斑点拾取器工具选择4,327,548和4,497,785个颗粒 ，然后将其提取在80像素盒中（傅立叶Binned 4.5×4.5） 。对于Fab -e络合物
，进行了两轮2D分类，导致选择了270,970个颗粒进行进一步处理
。从头算重建产生了一个定义明确的Fab-e复合物的重建。然后将属于此类的粒子重新提取在300像素盒中 。在提取过程中 ，粒子是由非全能值的傅立叶归纳
，最终像素大小为1.00
。随后，在带有C2对称性的提取的颗粒上进行了不均匀的细化60 ，从而产生了最终的重建，全局分辨率为3.3Å。类似地
，对于Fab – B复合物，进行了两轮2D分类 ，从而选择了187,608个颗粒进行进一步处理 。从头算重建产生了一个定义明确的Fab – B复合物的重建。为了识别数据集中的所有FAB-B复合物颗粒
，使用BLOB拾取工具（4,497,785个颗粒）挑选的所有颗粒均用于五轮异质性完善，使用从初始AB InitiO工作中重建Fab-b Complect的初始AB InitiO工作 ，作为高分辨率粒子的参考粒子
，以进一步隔离
。接下来是两轮从头开始的最后一轮，以进一步隔离最终重建的最佳质量颗粒。然后将其余的73,185个颗粒重新提取在360像素盒中 。在提取过程中 ，粒子是由非全能值进行傅立叶归纳
，最终像素大小为0.836Å
。随后， 在带有C2对称性的提取颗粒上进行了不均匀的细化60 ，产生了3.3Å的全局分辨率的重建。基于参考的运动校正成功地在72,998个重新提取的颗粒上进行 。然后将这些颗粒进行最终的不均匀细化
，并具有C2对称性为60，得出最终的重建 ，全局分辨率为3.2Å
。金标准傅里叶壳相关（FSC）标准（FSC = 0.143）用于计算所有分辨率估计，并在CryoSparc61中生成3D-FSC图。为了启用模型构建
，通过CryoSparc中的局部分辨率过滤全球精制的地图 。 　　最初，使用UCSF Chimera拟合在MAP TOOL63中 ，将先前确定的SARS-COV-2 M结构（PDB：8CTK；Ref
。34）和Fab-b的Alphafold2 Model62刚体固定在M – FAB – B-CIM地图中。然后
，使用NAMDINATOR64在合并模型上进行了初始的分子动力学柔性拟合，然后在COOT65中手动调整 。在后一个步骤中 ，使用配体构建器工具添加了CIM-834化合物
。选择CIM-834的姿势时
，请考虑以下内容。首先，密度的形态 。远离M两个倍对称轴的密度的平板状形态与CIM-834的哌啶和嘧啶环一致。密度相对端的密度较薄且分辨不清（扩展数据图6） ，这与分子在酰胺位置之外的灵活性的提高一致
。其次
，氢键伴侣的定位。CIM-834的选定方向将吡啶嗪环与S99和N117保持相邻，从而允许潜在的直接或水介导的氢键 。然后 ，使用COOT65和使用phenix66进行实际空间改进的手动模型构建的迭代循环来完善模型
。肘部用于生成CIM-834的配体约束（参考文献67）。使用Molprobity68,69,70进行模型验证 。 　　使用LIGPLOT71和UCSF CHIMERAX72计算M和CIM-834之间的相互作用
。使用默认设置
，使用UCSF Chimera Matchmaker工具来获得均方根偏差值。使用UCSF CHIMERAX72生成数字，该项目中使用的结构生物学应用由SBGRID73编辑和配置 。 　　Genscript合成了编码SARS-COV-2 S祖先Wuhan-Hu-1（GenBank：NC_045512.2）的尖峰蛋白的人类密码子优化基因
。如先前所述 ，SARS-COV-2 S拟态囊泡囊炎病毒（VSV）和中和测定法被重新构架74。简而言之，为了产生SARS-COV-2 S VSV
，用PCAGGS表达向量转染了Confluent HEK-293T细胞，用C末端的18-沉积物胞质尾部截断编码SARS-COV-2 S ，以增加细胞表面表达 。然后
，转染后48小时，将细胞用VSV G伪型VSVΔG感染 ，其中具有萤火虫荧光素酶报告基因
。然后
，24小时后，收集并阐明了含有SARS-COV-2 S型VSV的上清液 ，并将病毒滴定在VERO-E6细胞上。对于病毒中和化测定
，CIM-834和对照单克隆抗体87G7分别串行稀释三倍和五倍，然后在室温下以相等的SARS-COV-2 S PSEUDOTYPER型VSV预孵育1小时 。孵育后 ，将VERO-E6细胞与混合物接种
，并在37°C下孵育20小时。随后，将细胞用PBS洗涤一次 ，并用被动裂解缓冲液（Promega）裂解
。萤火虫荧光素酶的表达是在带有-luciferin作为底物（Promega）的Berthold Centro LB 960板灯发光仪上测量的。在缺乏的复合酶的存在下，在荧光素酶读出的荧光素酶读出的降低比率归一化为荧光素酶读出的情况下
，将病毒中和的百分比计算出来 。使用四参数Logistic回归（GraphPad Prism v.8.3.0）确定了半最大抑制浓度（IC50）
。 　　将HuH-7细胞在24孔板的盖玻片上播种，每个孔的浓度为8×104个细胞。第二天 ，将1 µM CIM-834或DMSO添加到培养基中
，并使用Transit-LT1转染试剂（Mirus Bio）将总计250 ng质粒编码为V5标记的WT-M进行转染 。然后，转染后16小时 ，在室温下用4％多聚甲醛在PBS中用4％多聚甲醛固定细胞20分钟
，然后在PBS中用0.1％Triton-X100在室温下用0.1％Triton-X100进行透化
。After a blocking step with 10% normal horse serum for 15 min at room temperature, V5-tagged M proteins were visualized by incubation with monoclonal anti-V5 antibodies (Thermo Fisher Scientific, 37-7500, clone 2F11F7, 1:500) in 10% normal horse serum, followed by incubation with Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG secondary抗体（Jackson Immunoresearch，715-545-151 ，1：500）。使用多克隆绵羊抗人TGN46抗体（AHP500
，Biorad，1：500）可视化反式高尔基网络 ，然后与Cy3偶联的驴抗sheep IgG IgG IgG抗体（Jackson Immunoresearch
，713-165-147，713-165-147 ，1：500）孵育 。使用1 µg mL-1的4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）可视化核
，并将盖玻片安装在Mowiol安装培养基中
。使用LSM 880共聚焦激光扫描显微镜（Zeiss）获取图像，并使用×63的石油增压物镜。通过使用ImageJ的Jacop插件来计算Pearson的相关系数来量化M和TGN46之间的共定位范围 。对于处理过的（1 µM CIM-834）和未处理（DMSO）条件 ，分析了25个细胞
。 　　SARS-COV-2 WUHAN-HU-1（GenBank：NC_045512.2）的编码序列用于重组蛋白表达。如前所述75 。蛋白质在大肠杆菌中表达
，并使用iMac钴珠通过亲和力纯化。In brief, after cell sonication in a buffer containing 50 mM Tris, pH 6.8, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 5 mM MgCl2 and 1 mM BME, supplemented with 0.25 mg ml−1 lysozyme, 10 μg ml−1 DNase and 1 mM PMSF, the proteins were purified through affinity chromatography with HisPur Cobalt resin 480（Thermo Scientific），在补充250 mm咪唑的缓冲液中洗脱之前 ，用盐浓度增加（1 m NaCl）和咪唑（20 mm）洗涤
。随后
，在50 mm Tris，pH 6.8 ，300 mM NaCl
，5 mM MGCL2和1 mm BME的最终缓冲液中，通过尺寸排斥色谱（GE SuperDex S200）纯化MTases。使用vivaspin 20离心浓缩剂浓缩蛋白质 ，并具有10 kDa MWCO（GE Healthcare
，VS2001），在不存在咪唑的情况下透析用于洗脱缓冲液 ，并在含有50％甘油的缓冲液中储存在-20°C下 。根据参考文献，纯化并组装了带有RDRP活性的复制/转录复合物
。76
，参考文献中描述的变化。77 。 　　一个荧光底物，该荧光材料包括SARS-COV-2 MPRO（Dabcyl-Ktsavlq↓SGFRKM-E（EDANS）-NH2）的切割位点和20 mM HEPES ，由120 mM NaCl
，NACL，0.4 mm EDTA ，4 mm EDTA
，4 mm dtt，20％glycerol ，ph 7.0
，ph 7.0，ph 7.0 ins ins ins in in 7.0 ins ins in in 7.0 ins ins in 7.0 ，在基于荧光谐振能量转移（FRET）的裂解测定78中
，在460 nm的发射波长下，使用Tecan Spark Multimode Multimode Multimode Mydimode Mydimode Microdoplate Reader在360 nm的激发下 ，在460 nm的发射波长下观察到EDAS的荧光信号
。将化合物用100％DMSO稀释以制备库存溶液。CIM-834的IC50在在37°C的反应缓冲液中以不同浓度从0到500 µm孵育0.5 µm的SARS-COV-2 MPRO和CIM-834后确定CIM-834的IC50 。最后，将最终浓度为50 µm的FRET底物以100 µL的最终总体积添加到每个孔中
，以启动反应
。IC50值是在GraphPad Prism 9.2.0软件的帮助下计算的。该化合物的抑制活性在一式三份中测量，数据表示为平均值±S.D 。还同时进行了两个针对MPRO的阳性对照测定（Nirmatrelvir和Nersitrelvir）
。 　　正如先前所述的75 ，在黑色384孔hibase非结合板（Greiner Bio One
，784900）中通过FRET确定了活性和抑制作用。In brief, increasing concentrations of inhibitor were incubated with purified PLpro protein (55 nM) in the presence of 5 μM of a fluorescent synthetic peptide (Dabcyl-FTLKGG↓APTK-Edans, Genscript) in HEP​​ES buffer (20 mM, pH 6.5) containing 120 mM NaCl, 0.4 mM EDTA, 4 mM DTT and 10% glycerol.DMSO的最终浓度调整为0.5％ 。荧光肽的裂解将Edans/dabcyl荧光团 - 猝灭剂对分开。通过监测使用Tecan Safire2荧光计在493 nm处的荧光发射的增加（在335 nm处激发），酶促反应的时间疗程进行了40分钟
。通过计算反应曲线线性部分的斜率来估算酶促活性 ，并相对于在没有抑制剂的情况下测量的活性进行标准化。 　　在IC50缓冲液（50 mM HEPES
，pH 8.0，10 mm KCl ，2 mM MNCL2
，2 mm MgCl2和10 mM DTT）中测定了导致聚合酶介导的RNA合成50％抑制的化合物浓度，其中包含7个增加的化合物（从1 µm到150 µm）和150 nm ，含有七个增加的化合物 。NSP8和450 nm NSP8L7（参考77）
。 　　反应在96孔nunc板上以40 µL的体积进行。使用Biomek i5自动化（Beckman）
，将所有实验均进行了机器人 。然后，将2 µL的每种稀释化合物在100％DMSO中添加到所选浓度中（5％DMSO终浓度）
。对于每种测定 ，（NSP8L7+NSP8）混合物在室温下8分钟后分布在井中，以预先形成活性复合物。然后将NSP12添加到井中并孵育8分钟 。通过添加UTP+Poly（A）模板混合物开始反应
，并使用350 nm的Poly（A）模板和750 µm的UTP终浓度在30°C下孵育20分钟
。 　　通过添加20 µL EDTA（100 mm）来停止反应测定。阳性和阴性对照由与5％DMSO（最终浓度）或EDTA（100 mM）而不是化合物的反应混合物组成 。然后，使用Biomek i5自动物（Beckman）将反应混合物转移到薄饼板上
。根据制造商的说明 ，将PICOGREEN荧光试剂在TE缓冲液中稀释至1/800
，并将60μl的试剂分布到Greiner板的每个孔中。将板在室温下在黑暗中孵育5分钟，然后使用Tecan Safire2和/或Clariostar在480 nm（激发）和530 nm（发射）下读取荧光信号 。 　　使用以下方程式确定IC50：活性酶的百分比= 100/（1+I2/IC50） ，其中i是抑制剂的浓度
，100％的活性是没有抑制剂的荧光强度。IC50是使用Prism软件从曲线拟合确定的
。对于每个测量，将三份获得结果。 　　将纯化的SARS-COV-2 NSP14（N7-MTase）和NSP10/NSP16（2'O-MTase）在含有40 mM Tris-HCl（pH 8.0） ，1 mM DTT
，1 mM MGCl2，1 mM MMMGCL2 ，1 mm MMMGCL2
，2μmSam和0.1μm3H-SAM（Perkin Elmer）（perkin Elmer）中，均为0.7.7.7.7.7.7.7,7,7us ，GPPAC4合成RNA79 。将化合物悬浮在50％DMSO中（最终DMSO浓度为2.5％）
。在30°C下进行反应，并在30分钟后通过冰冷的水稀释30倍。使用FILEMTAT收割机（Packard Instruments）将样品转移到二乙基氨基乙基滤镜垫（Perkin Elmer）中 。用10毫米铵甲酸铵（pH 8.0）洗涤RNA保留的垫子两次
，用水两次，一次用乙醇洗涤
。使用闪烁液（Perkin Elmer）将它们浸泡 ，并使用Wallac Microbeta Trilux液体闪烁计数器（Perkin Elmer）确定3H-甲基转移至RNA底物。 　　使用小鼠微粒级分（Gibco；最终蛋白浓度
，0.5 mg ml -1）确定化合物微粒体稳定性，并用仓鼠微粒级分（Xenotech; Xenotech;终蛋白浓度 ，0.5 mg mL -1）和人体微粒型（Xenotech;最终蛋白质浓度; Xenote; final protine; final protine; final protine;NADPH（最终浓度
，1毫米） 。在37°C下进行120分钟的孵育
。在不同的时间点（5 、15
、30、60和120分钟），对25μl的反应混合物进行采样 ，并在含有内标的300μl乙腈中淬灭。产生的悬浮液涡旋并离心
，并用水稀释上清液（两倍） 。通过用串联质谱法分析所得溶液，以确定化合物的半衰期
。 　　研究中的所有统计比较均在GraphPad Prism中进行（v.6.07 ，v.8.3.0
，v.9.2.0，v.10.1.2和v.10.2.3） ，所使用的统计检验在图传奇中指示。用于定量DMV的2D EM是从三个独立制剂中获取的 。在先前以2D表征的样品的一系列技术重复项上获得了断层扫描，除了HPF样品以一种制剂中的重复材料制备。 　　所有图形均使用GraphPad Prism（V.6.07
，V.8.3.0，V.9.2.0 ，V.10.1.2和V.10.2.3）制备
。使用Biorender.com和Adobe Illustrator 28.1（Windows）创建了数字和方案。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。