气道到脑的感觉途径介导了流感诱发的疾病

　　所有动物程序遵循《美国国家卫生研究院的护理与使用指南》中概述的实验动物的道德准则，所有方案均由哈佛医学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。将小鼠保持在恒定温度（23±1°C）和相对湿度（46±5％）的恒定温度下：黑暗循环。野生型C57BL/6J（000664），Nestin-Cre（003771），Phox2b-Cre（016223），Advillin-Creer（032027），Trpv1-Ires-Cre（017769），PDYN-IRES-CRE（017769），PDYN-IRES-CRE（017769）（027719），Oxtr-IRES-CRE（031303），AGRP-CRE（012899），LSL-DTR（007900），LSL-TDTOMATO（AI14，007914）购自杰克逊实验室。先前生成14,22,51。 　　流感A/PR/8/34（H1N1）购自Charles River Avian疫苗服务（10100374），EID50为1012 ml -1。除非另有说明，否则在无菌盐水中稀释病毒，用于施用的剂量。病毒施用改编自先前的研究52。手动约束清醒小鼠，并使用P200移液器缓慢地通过每个鼻孔（25μl总体积）输送流感病毒，以防止溢出或输送到口腔。给药后，小鼠用鼻孔直立将小鼠固定10-15 s，然后返回笼子。 　　为了分析流感病毒感染引起的行为变化的分析，没有性偏见的六到八周龄的小鼠被单独使用，可以免费获得食物和水。通过测量每日食物摄入量，每日饮水，体重和运动能力在接种前三天来获得基线值。病毒感染后，所有测量结果均以基线值的百分比变化表示。每天通过测量笼子中剩余食物和水的重量的变化来计算食物和水的摄入量。记录动物运动（C922X Pro Stream网络摄像头，Logitech），每天30分钟，并以MTRACK2插件（1.53Q，NIH）中的MTRACK2插件确定，以总距离表示。为了测量急性食物摄入量，将小鼠禁食24小时，并在黑暗的发作下用PGE2或Sulprostone（EP3激动剂，14765，Cayman Chemical Company）通过曝光途径给予小鼠，并在图中指示的剂量。然后将动物单独存放在干净的笼子中，并随意获取食物和水，并通过测量测试期间和之后的笼子中的食物来确定食用1小时的食物。 　　通过直肠探针或射电遥测监测核心体温。使用小鼠直肠温度探针（Kent Scientific，ret-3，0.16 mm尖端直径）每天每天每小时进行直肠探测测量值（Kent Scientific WD-20250-9）。对探针进行灭菌（70％乙醇），润滑（Aquagel润滑凝胶，Parkerlabs，57-05），并插入约5–7 mm的物理约束小鼠直肠，并记录温度30 s。对于射电遥测，将报告体温（HD-X11，DSI）的射电遥测设备手术植入了腹腔。在麻醉下用avertin（200 mg kg -1，腹膜内注射）进行手术，并对腹部区域进行了消毒和剃须。进行了一个约1厘米的切口，并轻轻暴露于Linea alba的腹部腹膜，以插入无菌射电遥测装置。手术部位用Vicryl缝合线（J392H，Ethicon）密封。动物在颈部后部皮下皮下皮下接受丁丙诺啡SR（BUPSR-LAB，ZOOPHARM，20 mg kg-1），并被允许恢复至少一周。通过接收器（EasyTel，Emka Technologies）连接到运行IOX软件v.2.10.8的计算机，在15分钟内收集体温数据。在给定的一天中，一只鼠标的所有数据点平均。 　　布洛芬（I4883）和阿司匹林（乙酰水杨酸，A5376）购自Sigma，PGE2受体拮抗剂SC-51322（2791），PF-04418948（4818），DG-0418），DG-041（6240）和Ono-ae-ae-ae3-35-258（4818）。每天将布洛芬（1 mg ml -1，盐水）加入饮用水，阿司匹林（20 mg kg -1，盐水）和PGE2受体拮抗剂（1 mg kg -1，盐水）每天注射（肠内）。在病毒接种前3天开始，施用环氧合酶-2抑制剂和PGE2受体拮抗剂，一直持续到监测期结束。他莫昔芬每天至少在流感病毒感染前一周至少一周，每天服用5天（腹膜内注射，70 mg kg -1）。 　　如前所述34，对NJP神经节注射AAVS或白喉毒素，并进行了较小的修饰。小鼠被麻醉（200 mg kg -1 avertin，腹膜内注射），并且由于缺乏脚趾捏反应，在整个手术过程中确保了麻醉深度。将NJP神经节暴露并串行注射（10×13.8 nl），并用盐溶液中含有AAV（滴定> 6.7×1012 Vg ML -1）或白喉毒素（5μgml -1，Sigma，Sigma），并用0.05％快速绿色FCF染料（Snarly Fcf dye（Snarly dupte））（Drummond）。AAV-cre (AAV-Syn-Cre-GFP, SignaGen Laboratories, SL100892, AAV9), AAV-flex-tdTomato (AAV9.CAG.Flex.tdTomato.WPRE.BGH, Addgene, 51503, AAV9), AAV-GFP (pENN.AAV.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG, Addgene,105542，AAV9）和AAV-FLEX-AP（AAV9.CAG.FLEX.PLAP.WPRE.BGH，CUSTON病毒，波士顿儿童医院病毒核心，波士顿，马萨诸塞州，AAV9）。快速的绿色FCF染料验证了成功的注射，慢慢地填充了整个神经节而不会泄漏。手术伤口用涂层的Vicryl缝合线（J392H，Ethicon）封闭，动物接受丁丙诺啡Sr（Bupsr-Lab，Zoopharm，Zoopharm，20 mg kg-1颈部后部的20 mg kg-1）作为镇痛药。动物至少恢复了两周的行为分析或四个星期进行组织学分析。 　　小鼠被麻醉（200 mg kg -1 avertin，腹膜内注射），并且由于缺乏脚趾捏反应，在整个手术过程中确保了麻醉深度。通过手术暴露了NJP神经节，并使用显微镜识别出脑咽咽神经并立即切断与神经节相邻的。假手术涉及NJP神经节暴露而无需神经横断。用涂层的Vicryl缝合线（J392H，Ethicon）闭合手术伤口，动物接受了20 mg kg-1丁丙诺啡Sr（Bupsr-Lab，Zoopharm，Zoopharm，Zoopharm，supciTaney the Back neck neck the Nectange）。动物在行为分析前至少恢复了两周。 　　在固定剂的心内灌注（10 mL PBS，然后在PBS中10 mL 4％多聚甲醛）后，对天然组织荧光进行了免疫组织化学和分析。对于全导管DTR免疫染色，在37°C下收集NJP神经节并透化并透化（11.5 g甘氨酸，400 mL PBS，含0.2％Triton X-100，100 mL DMSO），持续1周。然后在阻塞缓冲液（5％普通驴血清，017-000-121，杰克逊，0.05％tween-20/pbs）中阻塞神经节（1小时，室温），并与1：200抗DTR（HB-EGF，HB-EGF，goat，af259na，fisher cocientific）孵育（过夜，4°C）。洗涤样品（4×10分钟，PBS 0.05％Tween-20，室温），并与抗山羊Alexa 488溶液一起孵育（2小时，室温）（Jackson Immunoresearch，705-545-147，705-545-147，1：500在PBS中，PBS为0.05％Tween-20）。再次将组织再次洗涤（4×10分钟，PBS中的0.05％Tween-20，室温），安装（Fluoromount G中，SouthernBiotech）上的显微镜载玻片（Fisher Scientific），并使用Leica SP5 II共聚焦显微镜可视化并使用ImageJ（1.53Q）进行分析。对于环氧酶-2免疫染色，将鼻咽组织冷冻（15μm），用阻塞溶液阻塞（1小时，室温）（5％正常驴血清，pBS为0.01％Triton X-100），并孵育抗育（过夜，抗cox2抗体，Abcox2 Abcy，abcam abcam abcam ins ab1798800 ins ins ins abcox2）0.01％Triton X-100）。洗涤切片（3×10分钟，室温，带有0.01％Triton X-100的PBS），并用抗兔子Alexa 488溶液孵​​育（2小时，室温）（Jackson Immunoresearch，711-545-152，711-545-152，1：1,000 In PBS，PBS IN 0.01％Triton X-100）。再次洗涤切片（3×10分钟，室温，带有0.01％Triton X-100的PBS），用荧光量G培养基安装，并使用Leica SP5 II共共聚焦显微镜进行可视化。为了可视化脑干轴突，从注入AAV的小鼠中获得了脑干冷冻切除术（20μM），并如上所述处理，以用于鼻咽组织中的环氧酶-2免疫染色， 除抗体外，除了1：1,000抗GFP（鸡，GFP-1020，Aves Labs），1：1,000抗RFP（Rabbit，600-401-379，Rockland），反chicken Alexa 647（Jackson Immunoresearch，703-605-155，1：300）和Anti-Rimun cy3（Jackson Immunoresearch）和Anti Rimun cy3（Jackson cy3（Jackson cy3）111-165-144，1：300）。为了可视化鼻咽中的轴突，将固定的鼻咽（15μM）切片如上所述进行染色，用于环氧酶-2免疫染色，但使用抗RFP一级抗体，然后使用抗兔CY3二级抗体。For GABRA1 neuron innervation to the trachealis and inferior pharyngeal constrictor muscles, tissues were collected fresh, cut along the ventral axis for open-book visualization, fixed (4% paraformaldehyde/PBS either 1 h, room temperature or overnight, 4 °C), and stained for tdTomato as above for tdTomato visualization in nasopharynx, except primary antibody孵育（36 H，4°C）和随后的洗涤（3×12 h，4°C）更长。为了可视化碱性磷酸酶，将动物灌注PBS，并收集组织，固定（4％多聚甲醛，1小时，室温），并在冷PBS中洗涤。然后将组织在碱性磷酸酶缓冲液（0.1 M Tris HCl pH 9.5，0.1 M NaCl，50 mM MGCL2，0.1％Tween-20-20-20，5 mm levamisole）中孵育（70°C，2小时），并在碱性磷酸酶缓冲液中洗涤两次。根据制造商的协议，使用NCT/BCIP溶液（34042，Thermofisher Scientific）可视化碱性磷酸酶活性。将染色的样品固定后（4％多聚甲醛，隔夜，4°C），通过一系列乙醇洗涤脱水，并使用1：2混合苄醇（Sigma-Aldrich 402834-500ML）清除，并清除。然后沿着腹轴切割组织以进行开放式书目可视化。通过显微镜使用AxioZoom（Zeiss）捕获全座染色，并使用ImageJ（1.53Q）进行分析。 　　基于DNA的杂交链反应（HCR）探针针对PTGER3（LotNo。PRH698）和PHOX2B（LotNo。Prf341）购自分子仪器。Hybridization solution (30% formamide, 5× SSC, 9 mM citric acid (pH 6), 0.1% Tween-20, 50 μg ml−1 heparin, 1× Denhardt’s solution, 10% dextran sulfate), probe wash buffer (30% formamide, 5× SSC, 9 mM citric acid pH 6.0, 0.1% Tween-20, 50 μg ml−1肝素），放大缓冲液（5×SSC，0.1％Tween-20，10％硫酸葡萄糖）和荧光团标记的HCR放大器购自分子仪器。新鲜收集NJP神经节，安装在OCT（Sakura Finetek）并冷冻（10μm）。将组织固定后（4％PFA，PBS，室温，20分钟），洗涤（3×10分钟，PBS，PBS，室温），用1％过氧化氢处理（PBS，PBS，室温，20分钟），并用PTGER3和PHOX2B HCR探针孵育（0.4 PMOL，PMOL，HYBRIDIPIAD，HYBRIDIPIAD PLIDISIPAL IN ATA HUMIDIFIED COMBERMIFIED，377°°C，均为37°°C，然后用（1）3：1探针洗涤缓冲液洗涤组织（15分钟，37°C）：5×SSCT（5×SSC，0.1％Tween-20），（2）1：1探针洗涤缓冲液：5×SSCT：5×SSCT，（3）1：3探头洗涤液：5×SSCT：5×SSCT，和（4）5×SSCT。然后将组织与放大缓冲液（30分钟，室温）一起孵育，然后将荧光HCR放大器（6 pmol，Alexa594用于PTGER3 Probe，for Phox2b Probe）在放大缓冲液中（加湿室，室温，室温，过夜）。然后洗涤组织（5×SSCT，2×30分钟，1×5分钟，室温），安装在Fluoromount G培养基中，并通过共聚焦显微镜（Leica SP5 II）进行可视化。 　　本手稿中的所有UMAP图均由发布的单细胞转录组数据（GEO登录ID：GSE145216）22使用Seurat（4.1.0）和R Studio（4.1.2）制成。 　　小鼠PTGER3，GAPDH转录本和流感病毒核蛋白（NP）的水平是在从下丘脑，NJP神经节，鼻腔灌洗（用于上呼吸道分析）和/或BALF的cDNA中测量的。通过手术张开脖子并将21克导管插入气管，收集BALF。总共将3×1 mL的PBS缓慢注入肺部，然后将溶液轻轻吸入注射器并收集。离心收集的BALF（7分钟，400g，4°C），并将上清液（-80°C）存储直至分析。通过将针（26G）插入朝向鼻子的上部气管中进行进行鼻腔灌洗。通过插管的注射器（PE20聚乙烯套管，内径0.38 mm）通过针刺施用无菌PBS（1 mL），并在从鼻子上驱逐后收集。根据制造商的协议，使用Trizol（15596026，Thermofisher）和高容量的cDNA逆转录试剂盒（4368813，Thermofisher）从BALF，鼻腔灌洗液和均质组织合成cDNA。使用基因特异性引物，Powertrack SYBR绿色主混合物（A46012，Thermofisher）在QuantStudio 7 QPCR仪器（Thermofisher）上对cDNA进行了QPCR分析。GAPDH引物为GGGTGTGAACCACGAGAAATATG和TGTGAGGGGAGATGCTCAGTGTTG；PTGER3引物为caacctttttcgcctctg和tttctgcttctccgtgtgtgtg;和流感病毒核蛋白引物和Accattgttgttccaactccttt。将PTGER3和核蛋白的表达水平标准化为GAPDH水平。归一化是通过2 –ΔCT方法用于扩展数据图4a，而扩展数据的2 –ΔΔCT方法53则使用未感染的对照中的值增加了归一化。 　　流感A病毒感染后的不同时间点，将小鼠安乐死。使用0.5 M EDTA涂层针和注射器通过心脏穿刺收集全血，并与0.5 m EDTA（50μL）立即混合。通过离心（3,000 rpm，10分钟，4°C）分离血浆，并存储上清液（-80°C），直到ELISA分析。如上所述收集BALF。根据制造商的说明，通过ELISA（R＆D Systems，PGE2：KGE004B：KGE004B：KGE004B：kge004b：kge004b：dy410-5，ifnγ：dy485-05，iL-6：il-6：dy406-05）在血浆和/或BALF中测量PGE2和细胞因子水平。 　　从gabra1-ires-cre急性收集了NJP神经节；LSL-TDTOMATO小鼠并在解离溶液中孵育（37°C，90分钟，旋转）（Dulbecco的修改后的Eagle的培养基（DMEM），含有liberase（55 mg ML-1，Roche，Roche，05401135001），DNase（0.004％，0.004％，Worthington，LSS002007）。细胞比颗粒物（3分钟，300g，4°C），并重悬于0.2％的卵球形，0.004％DNase，DMEM，200μl。使用P200移液管，将细胞至少10次进行三次，直到不可见，通过40μm网状细胞滤网过滤，然后再次颗粒（3分钟，300g，4°C）。然后将细胞重悬于含有5μMCalbryte520 AM（20651，AAT Bioquest）的培养基中；培养基包含1×B27（Gibco，17504044），1×N2（Gibco，17502048），1×青霉素和链霉素（Gibco，15140122）在没有苯酚红（Gibco，12348017）的神经质培养基中。然后将重悬的细胞铺在粘贴蛋白涂层的盖玻片上，并在加湿的CO2孵化器中孵育（成像前37°C，至少30分钟）。然后将盖玻璃带到带有入口和出口灌注（Warner Instruments，RC-24N）的室内，并连续流动汉克的平衡盐溶液（HBSS）。然后对前列腺素E2（HBSS为1μM，2分钟）和KCL（150 mM）（在运行结束时）灌注时成像（488 nm）钙反应（488 nm）。通过TDTOMATO荧光（568 nm）鉴定GABRA1阳性神经元。如果平均calbryte 520 AM荧光在刺激期间的反应性响应性，则超过了基线平均值的三个标准偏差。 　　用PGE2（腹膜内注射，0.5 mg kg-1）或PBS急性注射使用突触软件（构建：94-42329P，Tucker-Davis Technologn），对AGRP神经元的纤维光度计进行了54。使用MATLAB（R2020A）分析数据。 　　图中的数据表示为平均值±s.e.m。行为实验的统计分析涉及平均每只小鼠指示的参数变化（感染后1-10天或通过生存）。使用Prism 8.4.3软件（GraphPad）计算统计显着性，并涉及图传奇中描述的统计检验。扩展数据中的概率分析图5B用SPSS，21（IBM）进行。根据我们的现场26,55的先前专业知识和出版物选择样本量，并在图中披露。将动物组随机分配，并将对照动物年龄与实验动物相匹配。同一研究者对疾病反应进行了基因分型和分析，因此数据未对基因型或实验组视而不见。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。