真菌细胞膜中磷脂的靶向磷脂

　　为了识别编码先前未知的含霉菌胺大花洛琳抗生素的潜在BGC，使用微生物基因组测序数据（包括“完整”，“染色体”，“支架”和“重叠式”组装水平，来自国家生物技术信息中心。此外，在我们实验室中测序的150个分离的链霉菌基因组被纳入了神秘数据库中。接下来，预测这些基因组中的假定BGC，并使用Antismash v.7.0进行注释，并具有四个额外的特征（即已知的群集爆炸，subcluster blast，Mibig cluster blast，Mibig cluster比较和活动位点查找器）11。使用DB-API数据库框架下的MySQL模型在本地服务器中进行了确定的BGC。使用11个已知的糖基转移酶序列构建了定制的概况隐藏模型（PHMMER）43在补充表1中详细介绍，并用于扫描局部不存在数据库。使用5E-181的截止E值来识别编码负责将霉菌胺基序转移到电势多烯大花生素抗生素的多烯大花环环上的糖基转移酶的序列。随后使用分子进化遗传学分析V.11（MEGA11）软件对候选序列进行修剪和对齐，并使用肌肉算法44。使用邻居加入方法构建了系统发育树，并在互动树（Itol）网站上进行了可视化。 　　为了验证Mand BGC并获得BIS-糖基化对应物，我们构建了聚酮化合物合酶基因（Δmandl）和Di-Digitoxose糖基转移酶基因（ΔMANDQ）的靶向缺失突变体（Δmandl）。简而言之，使用引物对Mandl_kouf/mandl_kodf/mandl_kodr mandl_kodr for mandq_kouf/mandq_kodr/mandq_kodf和mandq_kodf和mandq_kodr和mandq_kodr和mandq_kodr和mandq_kodr和mandq_kodr和mandq_kodr和mandq_kodr和mandq_kodr，从而从netropsis dsm 40259的基因组DNA中进行了两个片段，一个上游和一个下游。然后将这些扩增子克隆到向量PKC1139中用BAMHI进行mandl或XBAI的Mandq，产生质粒PKC1139-MANDL_KO和PKC1139-MANDQ_KO。随后通过大肠杆菌 - 链霉菌结合将这些构建体引入Netropsis DSM 40259中，并选择了抗Apramycin耐药的脱糖体并在30°C下在甘露醇大豆粉（MS）培养基中孵育，以产生双重杂交突变体。通过PCR分析，使用引物对Mandl_kouf/mandl_kodr和mandq_kotf/mandq_kotr验证了mandl和mandq的删除。通过Sanger测序进一步证实了所得的PCR产物。 　　Netropsis DSM 40259的孢子是通过在30°C的ISP4琼脂板上培养7天而产生的。使用无菌接种棒在250 mL损坏的埃伦叶瓶中，将孢子无菌接种到50 mL的胰蛋白酶肉汤起始培养物中。将烧瓶与搅拌在30°C下孵育2天。接下来，使用0.5 mL的胰蛋白酶大豆汤培养物在250 ml搅拌器的Erlenmeyer瓶中接种50 mL F2培养基（葡萄糖69 G L -1，牛肉提取物25 g L -1，CACO3 9 G L -1和KH2PO4 0.1 G L -1）。在FS/9培养基（大豆粉30 g l -1，葡萄糖40 g -l -1和Caco3 10 g l -1）中发酵麦芽孢菌素B。然后将烧瓶在30°C，200 rpm搅拌10天。使用N-丁醇以1：1的比例将培养物（包括菌丝体）提取过夜。将所得的有机提取物分离并使用旋转蒸发剂浓缩。然后，使用甲醇/水的逐步梯度洗脱（10％，30％，50％，70％，90％，90％和100％甲醇），将浓缩提取物在YMC-GEL C18柱上分离。使用超大性液相色谱 - 质量光谱法（Waters）鉴定含有大米霉素的馏分，并通过反相高性能液相色谱（HPLC； Shimadzu，Shimadzu，Shimnet He He c18-Aq，5μm最佳床均达到30％的MM-Min Min Mimn Mentive obd），进一步纯化了曼二霉素的纯形式，3 30×Min Min Miml Miml n Mm.Mm。在60分钟内，水中的乙腈在水中达到90％）。通过超强化液相色谱 - 质谱法证实了胸过霉素的纯度和身份。将靶HPLC级分组合并冻干，产生纯粉末，以进行随后的生物学测定。 　　为了阐明Mandimycin和Mandimycin B的结构，通过NMR光谱镜（Bruker Avance Neo 600 MHz和Bruker Avance III HD 700 MHz）和HR-ESI（Waters-GS-XS-XS-XS-XS-XS-QTOF和热科学ORBITIC ORBITIVE ORBITIVE ORBITIVE）分析了纯化的化合物。将一维（1H和13C）和二维（HSQC，HMBC，1H-1H-1H舒适，Tocsy，tocsy，tocsy，noesy）NMR分析溶解在二甲基亚甲基亚氧化二甲基氧化二甲基（DMSO）-D6中-D6中（DMSO）-D6中。（HSQC，异核单一量子相干性； HMBC，异核多键相关；舒适，相关光谱； tocsy，总相关光谱；噪声，核过度大关系效应光谱光谱法）。NMR数据是在配备有冷冻探针或Bruker Aviii 700 MHz仪器的Bruker Aviii 600 MHz仪器上获取的。据报道，使用残留的溶剂信号在1H NMR中为2.50 ppm，在1H NMR中以2.50 ppm为单位，在1H NMR中以二甲基硅烷为单位，在13C NMR中以39.5 ppm的速度为内部信号。通过直接输注，在正极和负电离模式下，在精确的Orbitrap质谱仪上获取了HR-ESI-MS数据。使用Xcalibur软件进一步处理获得的数据。补充信息中提供了对Mandimycin和Mandimycin B结构的NMR和HR-ESI-MS数据的详细解释。 　　通过按照临床和实验室标准研究所的指南来确定其MIC值，通过确定其MIC值来评估Mandimycin和Mandimycin B的体外抗菌效力。Mandimycin was tested against a panel of fungal pathogens as well as Gram-positive and Gram-negative bacterial pathogens, as detailed in Supplementary Table 4. The assays were performed in 96-well microlitre plates, with amphotericin B, vancomycin and ciprofloxacin serving as positive controls for fungal, Gram-positive and Gram-negative pathogens,分别。将所有测试化合物溶解在无菌DMSO（SCR，CN）中，以达到12.8 mg ML -1的浓度。从单个菌落中培养测定菌株，然后在新鲜的luria bertani（LB）（细菌）或酵母pept蛋白葡萄糖（YPD）（Fungi）培养基中稀释5,000倍。随后将微生物悬浮液分布到第一行（每孔100 µL）和其余行（每孔50 µL）中。使用两倍的连续稀释度以50 µl的体积在96孔板上连续稀释测试化合物，从而在64至0.125μgml-1之间提供每种化合物的最终浓度范围。为了避免边缘效应，每个板的顶部和底部排充满100 µL培养基。将板在37°C（细菌）或30°C（真菌）中孵育16小时。将细菌或真菌没有可见生长的最低浓度记录为MIC。所有测定均以重复进行，并重复三个独立时间。 　　使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基-2H-2H-四唑溴化物（MTT）测定法评估了Mandimycin和Mandimycin B的细胞毒性46。HEPG2（人肝癌细胞系），HK-2（人肾近端小管上皮细胞系），SK-HEP-1（人肝癌细胞系）和PANC-1（人胰腺癌细胞系）（人类胰腺癌细胞系）在DMEM中培养在DMEM中培养在DMEM中，并补充了10％的fetal bovine Elasem expeent Expient Expient Expient Expient Expient Expient Expare Exper Expare Expected。将RPTEC细胞培养在补充肾上皮细胞生长试剂盒的肾上皮细胞基础培养基中，直到达到指数相为止。随后，将细胞接种到96孔平底微片板中，每孔的密度为2500个细胞。在与5％CO2的37°C孵育24小时后，将培养基吸入并用100μl含有曼氏霉素或曼二霉素B的新鲜培养基代替，浓度在128μgml-1到0.25μgml-1。额外的48小时孵育后，除去培养基，并将110μlMTT溶液（10μl的PBS中的5 mg ml-1 mtt用100μLDMEM添加到PBS中）。将混合物在37°C下再孵育3小时，以使甲唑晶体形成，然后用100μl的溶解溶液（40％二甲基甲酰胺，16％十二烷基硫酸盐和2％乙酸在H2O中溶解）。使用微孔读取器（Epoch Microplate分光光度计，Biotek）以570 nm的光密度在570 nm处测量每个孔的吸光度。相对于没有任何化合物的对照井，计算了麦芽醛霉素和麦芽霉素B的半末端抑制浓度值（GraphPad Prism 9）作为抑制50％细胞生长所需的化合物浓度。所有实验均在三个生物学重复中进行。 　　真菌细胞膜成分对米霉素的抗真菌活性的影响，使用C. albicans BNCC 186382。在10％的无菌DMSO中制备了鞘氨质素，磷酸胆碱，磷酸糖苷，磷酸乙醇胺，β-1,3-葡聚糖，β-1,3-葡聚糖，β-1,6-葡聚糖和甘露糖。将每个溶液（10μL）添加到96孔微滴定板的单个井中，从而导致这些细胞膜成分的最终浓度为0.05、0.1、0.2、0.2、0.4、0.8、0.8和1.0 mg ml-1。使用对MIC分析的相同方法记录每种处理对白色念珠菌的MIC值。实验是在三个生物学重复中进行的。 　　使用ITC测量了曼二霉素与磷脂（磷脂酰胆碱，磷脂酰肌醇，磷脂酰辛基丝氨酸，心磷脂，鞘脂蛋白，鞘磷脂和磷脂酰甘油）的结合。使用ITC测量。通过混合DOPC（Avanti Polar Lipids）和每种磷脂的5％或氯仿中的5％制备具有0.1μM的LUVS（1：1）。将所得的脂质悬浮液蒸发至真空中的干性，以产生脂质膜，然后使用5 mM HEPES（pH 7.4，100 mm NaCl）再合化。随后，使用Avanti Mini挤出机通过0.1-μm滤膜将水合样品挤出了十倍。ITC实验使用1 mm的Mandimycin，Mandimycin B或两性霉素B以及600 µM DOPC LUV在25°C下在25°C的PEAQ-ITC仪器上进行。滴定过程涉及初始注入0.23μl，然后在80 s间隔注射2μL，并在500 rpm处连续搅拌。使用PEAQ-ITC软件分析了数据，并使用一次性位点模型计算了热力学参数（焓（ΔH），熵（ΔS）和平衡结合常数（明显KD））。 　　为了研究Mandimycin和Mandimycin B与固醇或磷脂之间的复合物的潜在形成，在既定方案中进行了UV -VIS结合测定法，进行了UV -VIS结合测定27。每种磷脂（即磷脂酰肌醇，磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油，心霉素和鞘脂素）和sterol（即成核酚和胆固醇）的储备溶液（即磷脂酰乙醇胺，磷脂酰乙醇醇，心脏磷脂）是在使用氯面浓度和随后的浓度来制备的。将甘霉素或甘霉素B溶解在DMSO中，以准备10 mm的储备溶液，该溶液使用DMSO进一步稀释至1 mM的工作浓度。两性霉素B和DMSO分别用作阳性和阴性对照。通过以各种比率混合库存溶液以达到1 ml的最终体积来制备配合物。然后将混合物在室温下孵育30分钟。在Thermo Scientific Multiskan Skyhigh仪器上记录了310至400 nm的UV -VIS吸光度光谱，并使用Origin 2021（v.9.8）绘制。 　　各种致病性真菌物种的单个菌落（C. auris bncc 357785，C。albicans bncc 186382，C。Neoformans BNCC 225501，C。glabrata bncc 337348和C. tropicalis bncc bncc bncc bncc 340288在5 ml ypd shecking conthight contunder conthight conthight conthight yp ypd broth condernectun conthight conthight conthight shecking conthight shecking。使用新鲜的YPD培养基将过夜培养物稀释至每100 µL 109个细胞的浓度，并将其镀到含有8×MIC的测试化合物的YPD琼脂板上（即，甘霉素，两性霉素B，Nystatin和Natamycin）。将板在30°C静态孵育2天，并观察并记录抗性菌落。使用与MIC分析所述相同的方法确定所选抗性突变体的MIC值。 　　这项研究（中国杭州医学院）使用了6周，重23-27 g的癌症研究（ICR）小鼠（ICR）小鼠。将小鼠随机饲养在单个笼子中，分为12组，每组4只小鼠。在实验之前，将小鼠适应3天。两性霉素B或没有任何抗生素的溶剂分别用作阳性对照和安慰剂。在包含10％DMSO和10％Tween 80的溶液中配制化合物。随后，每组小鼠每天接受皮下或静脉注射各种浓度的测试化合物或安慰剂。根据提供的方案，使用商业试剂盒（Cloud-Clone）测量了毒性相关生物标志物的蛋白质浓度，包括KIM-1，TIMP-1，LCN-2和SPP-1。使用逆转录PCR评估了KIM1，TIMP1，LCN2和SPP1的基因表达水平，并用GADPH作为对照。使用应用的生物系统定量3进行了定量。最后，将所有动物安乐死，并用催血蛋白和曙红（H＆E）收集，固定，解剖和染色。临床病理学家以双眼的方式评估并评估了管状变性，坏死，细胞铸造，扩张，拥塞和蛋白质铸件的病理变化。所有动物研究程序均由中国药物大学动物伦理委员会批准（批准数字2024-02-007和2024-09-130）。 　　当前的研究（中国杭州医学院）使用了6周，重23-27 g的特定不含病因的女性ICR小鼠。将小鼠随机饲养在单个笼子中，并在实验前3天适应。通过腹膜内注射150 mg kg -1和100 mg kg -1的环磷酰胺，在第1天和第4天诱导中性粒细胞减少症。C. bncc 186382，白色念珠菌BNCC 357785，Neoformans bncc C. c. c. c. c. c. c. c. c. c. c.c。neoformansbncc 225501或两栖动物 - 耐药蛋白C. auris amr005被接种到5 ml YPD液体中，并在30°C的220 rpm shake evernight。用0.9％的无菌盐水溶液将过夜的真菌培养物洗涤3次，然后稀释至最终浓度为2×107菌落形成单元（CFU）。通过肌内注射到两个大腿中，稀释的真菌悬浮液（50 µL）施用，每个大腿的接种物在每个大腿中提供约1.0×106 CFU。对于用加密赛车菌株的大腿感染模型，将小鼠用阶霉素（以10％DMSO+10％Tween 80的配方配制），每天，一次，一次，一次，一次，每天为10 mg kg-1，感染后6小时。两性霉素B，Rezafungin，Isavuconzole和5-氟环胞嘧啶用作对照。对于念珠菌菌株的大腿感染模型，将小鼠用20 mg kg-1、10 mg kg-kg-1和5 mg kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-1或媒介物（10％DMSO+10％tween 80）的剂量在2、10和18 h后用2，10和18 h治疗小鼠。将小鼠安乐死，大腿肌肉被无菌，加权，匀浆和枚举，以通过CFU计数在YPD琼脂上进行镀膜并在30°C下孵育。所有图形数据均显示为每组单个数据点，并使用GraphPad Prism 9对所有动物研究程序进行统计分析。所有动物研究程序均由中国制药大学动物伦理委员会批准（批准编号2023-08-08-018，2023-09-09-036和2023-036和2023-09-09-09-033）。 　　当前的研究（中国杭州医学院），使用了6周，重23-27 g的特定无育雌性ICR小鼠。将小鼠随机饲养在每个笼子中有四只小鼠的单个笼子中，并在实验前3天适应了3天。将白色念珠菌BNCC 186382的单一菌落接种到5 mL YPD液体培养基中，并在30°C，220 rpm的夜间摇动过夜。用0.9％的无菌盐水溶液洗涤过夜真菌培养，然后将其稀释至2×107 CFU ML -1的终浓度。随后，通过皮下注射到尾静脉中，通过皮下注射50 µL稀释的真菌悬浮液，导致血液中的接种物约为1×107 CFU。感染六个小时后，通过皮下注入的单剂量用1 mg kg -1、3 mg kg -1、3 mg kg -1、5 mg kg -1或10 mg kg -1（在10％DMSO和10％Tween 80）中进行治疗。For the oral administration group, mice were orally administered a dose of 10 mg kg−1 of mandimycin formulated in a solution containing 5% DMSO and 10% Tween 80. Twenty-four hours after infection, mice were euthanized, and their kidney and lung tissues were aseptically removed, weighted, homogenized and subjected to fungal burden enumeration by CFU counts after plating on YPD agar and在30°C下孵育。所有图形数据均显示为每个组的个别数据点，并使用GraphPad Prism 9对所有动物研究程序进行了统计分析。所有动物研究程序均由中国药物大学动物伦理委员会批准（批准编号2024-04-009和2024-03-019）。 　　当前的研究（中国杭州医学院），使用了6周，重23-27 g的特定无育雌性ICR小鼠。将小鼠随机饲养在每个笼子中有六只小鼠的单个笼子中，并在实验前3天适应了3天。为了诱导免疫抑制，小鼠在第-2天和第3天分别接受了腹膜内注射（200 mg kg -1）和皮下给药的乙酸可可酯（500 mg kg -1）。为了防止交叉感染，从第1天到第3天，以50μgml-1的浓度在饮用水中口服小鼠，然后从第9天到第9天的皮下注射头皮（每剂量5μg）的皮下注射（每剂量5μg）。感染后16小时，涉及皮下注射头皮状和每日单剂量的甘霉素，在1 mg kg -1，5 mg kg -1、10 mg kg -1和20 mg kg -1以及两性剂kg -kg -kg -1以及10 mg kg -1的两次连续几天中。总共监测小鼠20天，并使用GraphPad Prism 9绘制生存率。所有动物研究程序均由中国药物大学动物伦理委员会批准（批准编号2024-01-014）。 　　建立了小鼠皮肤感染模式，以评估Mandimycin在皮肤上处理真菌感染47,48,49的功效。本研究使用了相等数量的男性和女性BALB/C小鼠（中国杭州医学院）。将小鼠随机饲养在每个笼子中有四只小鼠的单个笼子中，并在实验前3天适应了3天。通过腹膜内注射50 mg kg -1的环磷酰胺在感染前的第三天和第一天诱导中性粒细胞减少症。随后，通过腹膜内注射将小鼠用50 mg-kg-1的果皮钠钠进行麻醉，并使用直径为0.8 cm的活检打孔器在背面皮肤上穿着全厚性皮肤穿孔。将白色念珠菌BNCC的悬浮液（每只小鼠1×108 CFU ML -1，10μl）接种到圆形伤口中，然后是温和的气流，直到皮肤显得湿润，但没有过多的液体。感染后一天，用曼二霉素（2.5 mg kg -kg -1或7.5 mg kg -1）局部治疗伤口，两性霉素B（2.5 mg kg -1或7.5 mg kg -kg -1）或载体（含有10％DMSO和10％TWEEN 80）。受伤但没有真菌感染的小鼠作为阴性对照，仅接受车辆治疗。所有化合物连续五天每天一次施用一次。拍摄伤口，并在感染后的第1、5、9和11天测量。在第11天，记录了伤口标本的真菌计数，并收集了伤口标本进行H＆E染色。所有动物研究程序均由中国药物大学动物伦理委员会批准（批准编号2024-02-003）。 　　重19-21 g的雌性BALB/C小鼠在实验前3天已适应3天。将小鼠随机饲养在每个笼子中有四只小鼠的单个笼子中，并在实验前3天适应了3天。在第1天，将小鼠皮下注入10 mg kg -1的雌二醇苯甲酸盐，连续五天连续五天诱导燃烧50,51。在第6天，用50μl白色念珠菌BNCC 186382悬浮液（1×1010 cfu ml -1）在静脉内接种小鼠，然后使用移液器将其倒置，然后在阴道接种后倒置5分钟。连续感染3天后，通常在自随意食物中喂食1天，然后接受皮下服用米霉素（10 mg kg -1），两性霉素B（10 mg kg -1），rezafungin（10 mg kg -kg -kg -1）或伊沙夫果唑（10 mg kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg-1）供50日感染了白色念珠菌但未用化合物治疗的小鼠用作对照组，并由含有10％DMSO和10％tween 80的PBS施用。在最终注射后的第二天，通过管道上的无菌PBS（20μl），通过管道和敏锐的C. Man，Rogs coma，Rogs C.MROMA，Rogs C.MR，可获得阴道冲洗，并通过无菌PBS（20μl）获得阴道。殖民地。最后，将所有动物用二乙醚麻醉，并安乐死以收集阴道组织，随后用4％多聚甲醛固定。解剖组织并进行H＆E和周期酸 - chiff染色进行组织学分析。所有动物研究程序均由中国药物大学动物伦理委员会批准（批准编号2024-02-003）。 　　研究中使用了不含特异性的雄性雄性Sprague-Dawley大鼠（180-220 g，7-8周大，每组n = 3）。将大鼠随机饲养在每个笼子中，每个笼子中有三只大鼠，并在实验前3天适应3天。通过皮下注射给大鼠25 mg -kg -1的脂霉素。血液样本（约0.15 mL）从颈静脉导管中收集到含有肝素钠的管，在给药前5、10、20和30分钟，并在给药后1、2、4、6、8、12和24小时。收集后，将每个血液样本放在冰上，然后离心（8,000克，5分钟）以分开血浆。然后将血浆转移并立即冷冻（在-70°C下或低于-70°C）直至分析。使用HPLC – ESI – MS/MS在AB Sciex Triple Quad 6500系统上与配备有足月溶剂Manager-R溶剂分配单元和样品管理器FTN-R Auto-Sampampler的HPLC系统结合使用HPLC – ESI – MS/MS中的Mandimycin在AB Sciex Triple 6500系统上分析。地西爱被用作内标。使用阳性离子模式的多反应监测用于量化Mandimycin的分析物的质量为M/z 1,198.30至m/z 725.20，而M/z 285.00则以内标准为M/z 193.00。通过HPLC（Waters Acerity C18色谱柱，1.9μM，100×2.1 mm）进行阶霉素和内标。由80％乙腈和20％（v/v）5 mM乙酸铵组成的等值流动相通过质谱电喷雾电离室以0.4 ml min -1的速率以0.4 mL min -1的速度组成。使用GraphPad Prism 9拟合血浆中的浓度。最大血浆浓度（CMAX），CMAX的时间，明显的消除半衰期，平均残留时间，血浆浓度 - 时间曲线下的面积，清除曲线，清除率和分布值的体积，使用非车间分析方法估算了使用Phoenix Winnonlinlin hinnonlinlin 8.3。生物利用度通过（Aucsubcutanies/aucintravenous）×计算（剂量/剂量刺激）×100％。所有动物研究程序均由中国药物大学动物伦理委员会批准（批准编号2024-02-006）。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。